[發明專利]羅丹明B的免疫親和柱-高效液相-質譜聯用檢測方法

無效

• 申請號: 201010600992.3
• 申請日: 2010-12-23
• 公開（公告）號: CN102087278A
• 公開（公告）日: 2011-06-08
• 發明（設計）人: 王利兵;胥傳來;宋珊珊;林菲;趙書閣;劉微波;趙媛
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N30/72;G01N30/14
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

羅丹明B的免疫親和柱-高效液相-質譜聯用檢測方法，具體涉及到免疫層析柱的的制備及實際樣品檢測，屬于免疫學檢測技術領域。

背景技術

近年來蘇丹紅，孔雀石綠事件給我國食品出口貿易帶來很大問題，造成我方的很大被動。像蘇丹紅本為工業染料，而非食品添加色素。但一些不法商人為了牟取高額利潤不顧消費者的健康問題，在食品中非法添加這些成本低、色彩鮮艷的工業染料。2008年衛生部發布《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》，明確規定蘇丹紅、堿性橙、酸性橙、羅丹明B類工業染料禁止在食品中添加。所以食品中違禁色素一直是食品安全檢測的重點。目前對違禁色素的檢測主要側重在儀器分析，對免疫分析涉及很少。免疫分析基于抗原抗體免疫反應的特異性較于儀器分析其特異性強、靈敏度高，不僅可以大大簡化甚至可以省去樣品前處理的復雜過程，而且避免了因大量使用溶劑而對環境的污染，再而免疫分析一般不需貴重儀器，具便攜性，不需要專門的技術人員，便于推廣。因此對違禁色素的免疫分析研究是必不可少的。

發明內容

本發明的目的是為了克服現有檢測技術的缺陷，建立一種方便快速的樣品處理方法，并在此基礎上建立羅丹明B的檢測方法。

本發明的技術方案：一種羅丹明B的免疫親和柱-高效液相-質譜聯用檢測方法，以抗羅丹明B的抗體與四甲氧基硅烷TMOS偶聯包埋于層析柱中，通過吸附、洗脫達到樣品凈化的效果，最后通過高效液相-質譜聯用檢測；?

1、羅丹明B免疫親和柱的制備，步驟為：

（1）取0.2mL的0.04mol/L?HCl溶液，0.75mL的去離子水，3.4mL的TMOS（四甲氧基硅烷）混勻。4℃保存2-3min；取出，超聲粉碎30min；

（2）取一質量已知的燒杯，吸取20μL羅丹明B抗體溶液，用PBS（0.01mol/L、pH7.4)稀釋至1mL，得羅丹明B抗體溶液，4℃保存。

（3）取步驟（1）超聲完全后的混合液，吸取其中1mL試樣，加入羅丹明B抗體溶液中，混勻，使之凝膠。

（4）待凝膠結束后，燒杯稱重，置于37℃恒溫烘箱凝膠老化，待凝膠失去初重的50%時，老化過程結束，將老化后的凝膠（約1g）研磨粉碎，裝柱。

（5）待柱中凝膠沉積穩定后，用5mL?pH7.4、0.01mol/L的PBS預淋洗，洗去未包埋的羅丹明B抗體和其他干擾雜質，最后用5mL?pH7.4、0.01mol/L的PBS平衡，即制得羅丹明B的免疫親和柱。

2、羅丹明B免疫親和柱的吸附、洗脫：

平衡：10mL?pH7.4、0.01mol/L的PBS；

上樣：待測的樣品溶液；

洗滌：用5mL?pH7.4、0.01mol/L的PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌；

洗脫：5mL甲醇洗脫，收集洗脫液待測。

3、高效液相-質譜聯用檢測，步驟為：

（1）以一定水平的羅丹明B加入辣椒粉樣品中，在室溫下至少靜置15?min；

（2）取上述添加羅丹明B的辣椒粉樣品1g，加入10mL含體積百分20%丙酮的正己烷，震搖10?min，靜置、過濾使分離出上層清液，殘渣加入10mL含體積百分20%丙酮的正己烷重復提取一次，合并2次提取液，混勻；

（3）移取提取液于氮吹儀上吹干，用0.01M?PBS重溶，吹干后的樣品用0.01M?PBS以質量計稀釋10倍；

（4）用10mL?0.01M?PBS平衡免疫親和柱；

（5）加樣，用5mL?0.01M?PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌，洗去未吸附樣品；

（6）5mL甲醇溶液洗脫柱上樣品，收集洗脫液；

（7）洗脫液經0.22?μm孔徑的聚四氟乙烯膜過濾后進行高效液相-質譜聯用檢測。

本發明的有益效果：本發明方法可以簡化羅丹明B殘留檢測的樣品處理過程，同時可達到凈化濃縮的效果，成本低廉，快速，便攜。

附圖說明

圖1羅丹明B標準溶液質譜標準曲線圖。

具體實施方案

1、羅丹明B免疫親和柱的制備：

（1）取0.2mL的0.04mol/LHCl溶液，0.75mL的去離子水，3.4mL的TMOS（四甲氧基硅烷）混勻。4°C保存2-3min；取出，超聲粉碎30min；

（2）取一質量已知的燒杯，吸取20μL羅丹明B抗體溶液，用PBS（0.01mol/L、pH7.4)稀釋至1mL，得羅丹明B抗體溶液，4°C保存。