[發明專利]人乳頭瘤病毒16和18型L1蛋白在酵母中的表達及應用

無效

• 申請號: 201010600193.6
• 申請日: 2010-12-22
• 公開（公告）號: CN102181426A
• 公開（公告）日: 2011-09-14
• 發明（設計）人: 王敏文;王玉峰;周長民;閆昆明;李春明;張千;王飛宇;聶飛;周蕾;郭文軍;高偉星;段廣宇;李衛東
• 申請（專利權）人: 大連雅立峰生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/37;C12N15/81;A61K39/295;A61P31/20
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 羅菊華

技術領域

本發明屬于生物技術領域，且涉及人乳頭瘤病毒16和18型L1蛋白在酵母，特別是釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)細胞中的表達及其疫苗制備方法。

背景技術

世界衛生組織(WHO)的統計資料表明，宮頸癌是嚴重危害婦女健康的侵染性疾病，其發病率僅次于乳腺癌，居全世界女性惡性腫瘤第二位，在一些發展中國家甚至居于首位。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，全球每年約有50萬名婦女罹患宮頸癌，且有將近30萬名婦女死于宮頸癌，其中，80％的死亡病例發生在發展中國家。據不完全統計，我國現有宮頸癌病人約13.8萬，每年約有5萬人死于宮頸癌，且發病率呈逐年上升、年輕化的趨勢。在1995年，WHO已將人乳頭瘤病毒(human?papillomavirus，HPV)的感染確定為宮頸癌的致病病因。幾乎所有的宮頸癌都由HPV引起，其中高達99.7％的宮頸癌患者都存在HPV感染，且超過2/3的宮頸癌病例由HPV?16型和18型引起。

人乳頭瘤病毒(Human?papillomavirus，HPV)是一種嗜上皮性病毒，其具有高度的特異性。HPV是一組病毒的總稱，其組成一個科，其中各病毒的形態類似，但DNA限制性內切酶圖譜不同，核殼體蛋白質的抗原性不同。目前已經確定的HPV型別大約有160余種，依其感染的上皮所在的部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，其中大約35種型別可感染婦女生殖道，大約20種與腫瘤相關。依據HPV導致腫瘤的危險性的高低，將HPV分為低危險型別HPV和高危險型別HPV。低危險型別HPV包括HPV6、11、42、43、44等型別，其通常引起外生殖?器濕疣等良性病變，包括宮頸上皮內低度病變(CINI)。高危險型別HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型別。高危險型別HPV，特別是HPV16和18型，與宮頸癌及宮頸上皮內瘤變(CIN?II/III)的發生相關。

近十幾年來，HPV疫苗研究可以分為兩類，即預防性疫苗研究和治療性疫苗研究。預防性疫苗一般以HPV16主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2為靶抗原，其作用在于誘發機體產生特異性的中和抗體和有效的局部免疫應答，以阻止HPV的長期感染和再感染。HPV的衣殼蛋白在真核以及原核表達系統中表達時，能自我裝配或形成病毒樣顆粒(VLP)，其結構和抗原表位與天然的病毒顆粒十分相似。VLP能與細胞受體結合并進入細胞，從而有利于抗原的加工呈遞以及誘發較強的細胞免疫。治療性疫苗通常是以經修飾的HPV16早期蛋白(其轉化活性被去除，但仍保留抗原性)作為靶抗原，它可誘導特異性的細胞免疫應答，從而可用于控制或消除感染HPV的良性和惡性病灶，并可作為這類疾病的手術后的輔助治療。在大多數與HPV16相關的宮頸癌及其癌前病變中，HPV16的E6和E7蛋白持續表達，而這種持續表達是腫瘤細胞轉化和維持惡性特征所必需的，并且正常組織中不存在這兩種蛋白。因此，E6和E7蛋白為用于HPV16相關宮頸癌及癌前病變的治療性疫苗的理想靶抗原。針對中晚期宮頸癌病人手術后殘留的腫瘤細胞，可應用這種治療性疫苗，以通過激發病人的細胞免疫來殺傷、清除這些腫瘤細胞和已感染的上皮細胞，從而防止或限制腫瘤的復發和擴散。預防性和治療性HPV疫苗的作用也有交叉。例如，在良性疣和輕度CIN病變中存在HPV晚期蛋白的表達，因此，預防性疫苗對這些疾病也有一定治療作用。近年來研制的一些疫苗，如嵌合性疫苗、HPV假病毒疫苗等，同時具備預防和治療雙重作用。

HPV疫苗在預防導致宮頸癌的持續性感染方面，有效率達到100％，它能將宮頸癌發生率降低75％，安全性好。目前國際上已有多個HPV16候選疫苗進入I/II期臨床試驗，這種疫苗將會拯救成千上萬的婦女的生命，因此對婦女的健康產生重大影響。

默克公司于1991年從澳大利亞CSL公司獲得專利授權，通過使用釀酒酵母表達，制備了針對HPV?6、11、16和18型的四價HPV疫苗。而葛蘭素史克公司的HPV疫苗技術來源于MedImmune公司，該疫苗為2價疫苗，商品名為“Cervarix”(預防16、18型)，其使用昆蟲細胞進行表達。這兩種疫苗均可以迅速使受試動物產生對HPV病毒的中和抗體，并且對人畜安全，能夠有效預防治療HPV病毒所導致的各種疾病，特別是梅毒和宮頸癌。這些技術已在國際權威專業雜志上公開發表、部分內容已經獲得美國等多個國家專利保護。