[發明專利]解淀粉芽孢桿菌LS05漆酶及其應用

無效

• 申請號: 201010599793.5
• 申請日: 2010-12-22
• 公開（公告）號: CN102154152A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 盧磊;趙敏;王天女;李泰侖;杜美惠;趙麗艷;汪春蕾
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/02;C12N15/53;C12R1/07
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技術領域

本發明涉及一種細菌漆酶，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌LS05的芽孢漆酶的制備和催化性質，以及編碼該芽孢漆酶的核酸片段。此外，本發明還涉及到該芽孢漆酶使合成染料脫色的方法，屬于應用微生物領域。

背景技術

漆酶(EC?1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，它可利用活性中心的銅離子催化氧化多種結構的芳香化合物，同時將分子氧還原成水。由于漆酶催化的底物范圍十分廣泛，因此漆酶酶已被廣泛應用于造紙工業、紡織工業、食品工業以及土壤的生物修復等領域。

漆酶催化氧化底物一般包括兩種作用方式，第一種是底物分子直接與漆酶銅簇反應氧化成相應的激發態分子。然而有些底物不能由漆酶直接氧化，原因在于它們分子太大而不能滲透進入酶的活性部位，或者由于其氧化還原電位較高而不能被漆酶直接氧化。漆酶氧化底物的第二種方式是通過一些小分子的介體物質為媒介，漆酶先將小分子介體氧化成激發態，然后這些激發態的介體再與大分子的或氧化還原電位較高的底物反應，該方式也被稱為漆酶-介體系統(LMS)。漆酶-介體系統的應用有助于進一步擴大漆酶的底物范圍，提高漆酶的工業應用范圍。

在自然界中，漆酶廣泛分布于植物、真菌和細菌中，特別是真菌，是目前漆酶的主要生產者。雖然目前對細菌漆酶的理論研究不如真菌漆酶深入，但細菌具有生長快、易于培養的特點，細菌漆酶較真菌漆酶在堿性環境和高溫下具?有更好的穩定性。由于工業造紙廢水等一般溫度較高，堿性較強，真菌漆酶在實際應用中受到穩定性差的限制，因此細菌漆酶在工業上具有更好的應用前景。

漆酶在細菌中的存在主要有三種形式，即：細胞外漆酶、細胞內漆酶和細胞組成漆酶。得到的這三種形式的酶，酶的活性及穩定性不同。由于胞內酶需破壁獲得，此形式的漆酶在破胞過程中酶活性降低較明顯，且隨著細胞的破碎各種細胞組份與漆酶混合，對酶的純化也會帶來困難；與之相比，另外的兩種形式漆酶則優勢顯而易見，尤其是細胞組成漆酶，通常是芽孢菌屬的細菌，由于細菌芽孢對高溫、高壓、極端pH以及高鹽等多種不利因素具有較強的抗逆性，該種類漆酶會因芽孢這一特殊構造的特性而表現出更好的溫度穩定性和pH穩定性。

隨著分子生物學技術的不斷發展，眾多的漆酶基因已經得到了克隆和深入分析。研究漆酶編碼基因的表達調控機制，有助于闡明不同基因在發育進程中所起的作用，此外，還可以通過定點誘變等技術對漆酶基因進行改造，提高漆酶工業應用性能。

染料被廣泛應用于紡織、印染、皮革等行業，全球每年生產染料萬種之余，至少有10-15％的染料通過廢水排放到自然環境中，對水體的生態環境造成嚴重破壞。工業使用的合成染料多是芳香族化合物，結構復雜，難降解。目前染料廢水的處理方法主要有物理化學法和生物處理法，物化處理技術費用高，存在二次污染，生物法因其經濟環保而成為較好的治理方法。其中漆酶由于具有廣泛的底物作用范圍，可催化降解多種結構的染料，在工業染料廢水處理上具有較好的應用前景。已有很多關于應用白腐菌或其它真菌來源的漆酶脫色染料的研究，但關于細菌漆酶以及細菌漆酶-介體系統在染料脫色方面的研究報道較少。通過研究細菌漆酶對不同合成染料的脫色效果，可以進一步推動細菌漆酶?的工業應用。

發明內容

本發明目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)LS05，同時本發明的目的還在于提供一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)LS05產芽孢漆酶的制備，以及提供一種利用解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)LS05產的芽孢漆酶脫色合成染料的方法。

本發明提供的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)LS05已于2010年10月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNo.4264。

上述解淀粉芽孢桿菌菌株是從中國黑龍江省伊春市涼水國家自然保護區的森林表層土壤分離獲得。解淀粉芽孢桿菌LS05菌株革蘭氏染色陽性，芽孢中生，有鞭毛。在固體Luria-Bertani(LB)培養基上，37℃培養24h，菌落微黃色、扁平呈圓形，菌落表面干燥、光滑，菌落邊緣呈葉狀，菌落不透明且正反顏色一致。菌株的最適生長溫度為37℃，最適生長pH為7.0，可耐受1％-13％的NaCl。

本發明提供了解淀粉芽孢桿菌LS05產芽孢漆酶的產孢培養培養基配方及芽孢漆酶的制備。