[發明專利]一種從水稻種子中提取重組人血清白蛋白的方法

有效

• 申請號: 201010597544.2
• 申請日: 2010-12-20
• 公開（公告）號: CN102127164A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 楊代常;何洋;李光飛
• 申請（專利權）人: 武漢禾元生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種從水稻種子中高效提取重組人血清白蛋白(rHSA)的方法。

背景技術

人血清白蛋白(human?serum?albumin，HSA)是由585個氨基酸組成的單鏈無糖基化的蛋白質，分子質量為66.5kD，等電點在4.7-4.9之間。它是人體血漿中最豐富的蛋白質，占血漿總蛋白的60％左右。每升人血含有HSA約40g。HSA除存在于血漿中外，還存在于組織、身體的分泌液、皮膚和淋巴腔中。在人的正常生理條件下，HSA具有維持血漿膠體滲透壓、營養和促進傷口愈合的作用，而且其作為載體物質，參與諸多疏水性生物分子如激素、生物學活性物質及藥物在血液中的運輸。因此，HSA是一種重要的醫用蛋白質，在臨床上主要用于治療因失血、燒傷、燙傷、整形外科手術及腦損傷引起的低蛋白血癥以及肝硬化、腎水腫等。

目前，臨床上使用的HSA主要是從人源血漿中提取和分離制得。然而，這種制備途徑存在以下缺點：一方面血漿來源受到限制，即有限的血液來源難以滿足生產HSA和其相關制劑的需求；另一方面血液自身也可能存在風險，例如可能含有危險的傳染病原體如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人們對于使用血漿中提取的HSA存在巨大的擔憂。因此，尋找其他途徑生產人血清白蛋白成為當務之急。

隨著現代DNA重組和合成技術的發展，研究人員對重組人血清白蛋白(rHSA)的生產和應用產生了極大的興趣。迄今為止，人們已經試圖利用各種不同的表達系統來大批量生產rHSA，例如利用原核生物如大腸桿菌(Latta，M.et?al.，Bio/Technology，5：1309-1314，(1987))、枯草芽孢桿菌(Saunders，C.W.et?al，J.Bacteriol.169：2917-2925，(1987))，真核生物如酵母(WO?00/44772，EP0683233A2，US?5612196)、動物細胞培養等生產rHSA。但這些方法因表達水平較低或生產成本較高，不能用于工業化生產。

本發明人的中國專利申請No.200510019084公開了一種利用水稻胚乳細胞作為生物反應器生產rHSA的方法，包括利用水稻胚乳特異性表達的啟動子和信號肽，介導rHSA進入水稻胚乳細胞的內膜系統，并儲存到水稻胚乳的蛋白體中，從而使rHSA能在水稻種子內大量積累，最終達到較高的表達水平。所得的rHSA的表達水平至少達到水稻種子重量的0.3％以上。該方法具有表達量高、成本低的優勢，為蛋白藥物的生產開辟了一條新途徑。

目前，還沒有從轉基因水稻中提取rHSA的成熟生產工藝，建立從轉基因水稻種子的提取蛋白質的方法和工藝，最大限度地增加目標蛋白的提取效率、降低非目標蛋白的提取率是研究和開發工藝的關鍵要素。提高rHSA的提取得率是提高生產效率并降低生產成本的最有效途徑。本發明建立了從水稻種子中規模化高效提取重組人血清白蛋白的工藝和流程。

發明內容

本發明的目的是提供一種從轉基因水稻中高效提取重組人血清白蛋白(rHSA)的方法。

為了實現上述目的，本發明提供以下技術方案：

一種從轉基因水稻中提取重組人血清白蛋白的方法，包括步驟：

1)將含有重組人血清白蛋白的轉基因稻谷去殼、稻米粉碎后獲得的轉基因米粉與提取緩沖液混合，攪拌提取，得混合物I；

2)調節步驟1)的混合物I的pH至4.0～4.5，室溫沉淀3～12小時，得混合物II；

3)過濾步驟2)的混合物II，收集濾液，獲得含有高濃度重組人血清白蛋白的溶液。

具體地，步驟1)中，根據重組人血清白蛋白在存在于水稻胚乳細胞的淀粉粒之間，為了去除雜蛋白的提取率，將含有重組人血清白蛋白的轉基因稻谷去殼后，糙米粉碎為80～120目的米粉，以提高重組人血清白蛋白的提取效率。

所述提取緩沖液包含20～30mM磷酸鹽緩沖液、10～20mM醋酸鈉、10～20mM硫酸銨與5～20mM辛酸鈉，提取緩沖液的pH為6.5～8。

為了獲得最高重組人血清白蛋白的提取率和平衡提取體積與提取效率的關系，米粉與提取緩沖液可以以重量/體積比(kg/l)，米粉重量/提取緩沖液體積)1∶5～1∶10的比率混合，以每分鐘60轉的速率進行攪拌提取1～3小時。經過實驗發現，1∶5～1∶10之間的對總蛋白和重組人血清白蛋白的提取量沒有明顯影響，從降低成本和減少體積考慮，所述轉基因米粉與提取緩沖液優選地以重量/體積比(Kg/L)1∶5混合，提取時間優選為1～1.5小時。