[發(fā)明專利]一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010597019.0
• 申請(qǐng)日: 2010-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102128931A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡華;胥傳來(lái);陳偉;朱潁越;孫鳳霞;彭池方;胡擁明;王利兵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/64
• 分類號(hào): G01N33/64;G01N33/532;G01N33/543
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

技術(shù)領(lǐng)域

一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測(cè)方法，屬于分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

食品安全問(wèn)題是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的大問(wèn)題。近年來(lái)，食品安全事件頻繁發(fā)生，對(duì)食品安全檢測(cè)人員提出了更高的要求。ELISA以及金標(biāo)試紙條的出現(xiàn)，一定程度上極大地解決了食品安全快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。然而，隨著科技的進(jìn)步，對(duì)于食品中超痕量的有毒有害物質(zhì)的檢驗(yàn)，仍然沒(méi)有得到很好的解決。諸如液相色譜，氣相色譜能夠在一定程度上滿足超靈敏檢測(cè)，但由于昂貴的價(jià)格及專業(yè)的操作要求，使得不能很好的滿足現(xiàn)場(chǎng)快速超靈敏檢測(cè)的要求。

納米技術(shù)的快速發(fā)展及在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛運(yùn)用產(chǎn)生了很多交叉學(xué)科的新技術(shù)。美國(guó)的Mirkin等人利用金納米粒子的獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，建立了基于金納米粒子的比色分析法。國(guó)內(nèi)的樊春海等人利用金納米粒子的標(biāo)記作用，建立了基于金納米粒子的電化學(xué)檢測(cè)方法。美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院建立了基于磁性納米粒子的核磁共振免疫分析方法，實(shí)現(xiàn)了高通量超靈敏檢測(cè)。到目前，仍未見(jiàn)將納米技術(shù)與ELISA技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法。本發(fā)明報(bào)道了將納米標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相結(jié)合的超靈敏檢測(cè)方法的建立。研究結(jié)果表明基于金納米粒子標(biāo)記及后續(xù)的銀沉積增強(qiáng)的研究，能夠很好地提高檢測(cè)靈敏度，從而為食品安全檢測(cè)提供了行之有效的超靈敏檢測(cè)新方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種基于納米金標(biāo)記及銀沉積增強(qiáng)的超靈敏食品安全檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種基于銀增強(qiáng)的甲羥孕酮的檢測(cè)方法，基于膠體金標(biāo)記及銀沉積增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的超靈敏檢測(cè)方法，共分5個(gè)步驟：（1）膠體金的制備，（2）抗體的膠體金標(biāo)記，（3）膠體金表面銀原位沉積、溶解及測(cè)定，（4）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，（5）實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中甲羥孕酮MPA的檢測(cè)；

（1）膠體金的制備：

向處理過(guò)的干凈的三角燒瓶中加入50?mL質(zhì)量濃度為0.01%的氯金酸溶液，攪拌，加熱至沸騰，保持5min；一次性加入質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱保持沸騰邊攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍(lán)黑色，至深藍(lán)黑色最后變成酒紅色，當(dāng)顏色不再變化后，繼續(xù)加熱沸騰15?min使反應(yīng)充分完全；最后，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，加蒸餾水定容到50mL，得膠體金溶液，4℃保藏備用；

利用Frens法制備18nm左右的膠體金，此法簡(jiǎn)便，粒徑均勻；

（2）抗體的膠體金標(biāo)記：

用0.1M的K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為9.0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗體，使羊抗兔二抗抗體的濃度為100μg/mL，并在室溫下反應(yīng)4h后，離心并重新分散于0.01M?pH7.4的PBS緩沖溶液中，得50μg/mL的金標(biāo)羊抗兔二抗，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（3）膠體金表面銀原位沉積、溶解及測(cè)定：

用100?mL?MPA-OVA的包被原包被96孔板，4℃過(guò)夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包被原；用含1%?BSA的0.01?M?PBS封閉96孔板，在37℃孵育1h，用PBST溶液洗板3次；向96孔中加入不同濃度MPA的標(biāo)準(zhǔn)溶液或?qū)嶋H樣品溶液，加MPA的兔一抗，并在37℃孵育2h；用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100?μL?的50μg/mL金標(biāo)羊抗兔二抗，在37℃條件下孵育2h；用PBST溶液3次洗板之后，每孔加入100μL的銀還原體系反應(yīng)30min，用PBST溶液洗板5次后，向每孔加入200?μL的濃硝酸，然后震蕩反應(yīng)2h，提取每孔的銀溶液后，用原子吸收光譜進(jìn)行定量分析；

所述銀還原體系由?(a)?質(zhì)量濃度2%的明膠溶液6mL，(b)?質(zhì)量濃度5.7%?對(duì)苯二酚3mL，(c)?pH?3.5?檸檬酸緩沖液1mL，和(d)?質(zhì)量濃度2%?AgNO₃溶液200?μL四種溶液組成的銀還原體系；

（4）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)步驟（3）所述由原子吸收光譜測(cè)定的銀的濃度值，建立MPA的濃度與銀的濃度值（吸光度值）之間的關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（5）實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中MPA的檢測(cè)：步驟（3）中的由實(shí)際樣品溶液所測(cè)得的銀的濃度值（吸光度值）與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，確定實(shí)際樣品中MPA的濃度。