[發明專利]一種基于銀增強的甲羥孕酮的檢測方法

無效

• 申請號: 201010597019.0
• 申請日: 2010-12-21
• 公開（公告）號: CN102128931A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 匡華;胥傳來;陳偉;朱潁越;孫鳳霞;彭池方;胡擁明;王利兵
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/64
• 分類號: G01N33/64;G01N33/532;G01N33/543
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種基于銀增強的甲羥孕酮的檢測方法，其特征在于基于膠體金標記及銀沉積增強檢測信號的超靈敏檢測方法，共分5個步驟：（1）膠體金的制備，（2）抗體的膠體金標記，（3）膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定，（4）建立標準曲線，（5）實現實際樣品中甲羥孕酮MPA的檢測；

（1）膠體金的制備：

向處理過的干凈的三角燒瓶中加入50?mL質量濃度為0.01%的氯金酸溶液，攪拌，加熱至沸騰，保持5min；一次性加入質量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，邊加熱保持沸騰邊攪拌，溶液顏色從淡黃色依次變成淺藍黑色，至深藍黑色最后變成酒紅色，當顏色不再變化后，繼續加熱沸騰15?min使反應充分完全；最后，在攪拌的條件下，溶液冷卻至室溫，加蒸餾水定容到50mL，得膠體金溶液，4℃保藏備用；

（2）抗體的膠體金標記：

用0.1M的K₂CO₃溶液調節膠體金溶液的pH值為9.0，然后向其中加入羊抗兔二抗抗體，使羊抗兔二抗抗體的濃度為100μg/mL，并在室溫下反應4h后，離心并重新分散于0.01M?pH7.4的PBS緩沖溶液中，得50μg/mL的金標羊抗兔二抗，4℃保存備用；

（3）膠體金表面銀原位沉積、溶解及測定：

用100?mL?MPA-OVA的包被原包被96孔板，4℃過夜，用PBST溶液洗板去除未包被的包被原；用含1%?BSA的0.01?M?PBS封閉96孔板，在37℃孵育1h，用PBST溶液洗板3次；向96孔中加入不同濃度MPA的標準溶液或實際樣品溶液，加MPA的兔一抗，并在37℃孵育2h；用PBST溶液洗板5次后，每孔加入100μL?的50μg/mL金標羊抗兔二抗，在37℃條件下孵育2h；用PBST溶液3次洗板之后，每孔加入100μL的銀還原體系反應30min，用PBST溶液洗板5次后，向每孔加入200μL的濃硝酸，然后震蕩反應2h，提取每孔的銀溶液后，用原子吸收光譜進行定量分析；

所述銀還原體系由?(a)?質量濃度2%的明膠溶液6mL，(b)?質量濃度5.7%?對苯二酚3mL，(c)?pH?3.5?檸檬酸緩沖液1mL，和(d)?質量濃度2%?AgNO₃溶液200μL四種溶液組成的銀還原體系；

（4）建立標準曲線：根據步驟（3）所述由原子吸收光譜測定的銀的濃度值，建立MPA的濃度與銀的濃度值之間的關系，建立標準曲線；

（5）實現實際樣品中MPA的檢測：步驟（3）中的由實際樣品溶液所測得的銀的濃度值與標準曲線對照，確定實際樣品中MPA的濃度。