[發明專利]一種抗三聚氰胺單克隆抗體及檢測三聚氰胺的試劑盒

有效

• 申請號: 201010595881.8
• 申請日: 2010-12-20
• 公開（公告）號: CN102168071A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發明（設計）人: 薛峰;蔣原;吳艷濤;高海崗;張睿;李旭輝;陶宏錦;張小榮;劉秀梵;趙紅霞
• 申請（專利權）人: 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心;江蘇中測檢測服務有限公司;揚州大學;蘇州艾瑞德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/18
• 分類號: C12N5/18;C07K16/18;G01N33/577
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及抗三聚氰胺單克隆抗體及其應用。

背景技術

三聚氰胺(Melamine)簡稱三胺，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺或氰脲三酰胺，分子式C₃N₆H₆或C₃N₃(NH₂)₃。三聚氰胺是一種重要的化工原料，廣泛運用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫藥等行業。

三聚氰胺被禁止作為食品和動物飼料添加劑。非法添加三聚氰胺的案例不僅發生在中國，我國曾從馬來西亞、泰國、秘魯、澳大利亞等國家進口的魚粉、寵物食品中檢出三聚氰胺陽性，美國FDA也曾在美國國內生產的飼料中發現含有三聚氰胺。三鹿集團等使用“毒奶”生產的嬰幼兒奶粉等奶制品流入全國市場后，導致眾多嬰幼兒因食用含三聚氰胺的嬰幼兒奶粉引發泌尿系統疾患，多名嬰幼兒死亡。

目前國內乳品企業大都采用“凱氏定氮法”來檢測原料奶的含氮量，以此來估算蛋白質含量。三聚氰胺的含氮量為66.6％，而蛋白質的含氮量一般不超過30％。因此，三聚氰胺常被非法用作添加劑，以提升檢測中的蛋白質含量指標。以牛奶蛋白質含量為2.8％計算，含氮量為0.44％；奶粉蛋白質含量為18％計算，含氮量為2.88％。而三聚氰胺含氮量為牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高0.4％蛋白質。

目前檢測三聚氰胺的方法為高效液相色譜法(High-performance?liquidchromatographic，HPLC)，對儀器設備和人員操作的要求均較高，檢測成本高，難以滿足對大批量樣品檢測的需要。

發明內容

本發明的目的是制備抗三聚氰胺單克隆抗體，用于建立快速檢測食品中三聚氰胺殘留的免疫學方法，所述的方法為競爭法酶聯免疫試劑盒與膠體金試紙條。

本發明提供一種產生抗三聚氰胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC?No.4303，分類命名為三聚氰胺特異性淋巴細胞雜交瘤株B-4B5-F10-B11。保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

本發明還提供制備產生抗三聚氰胺單克隆抗體的雜交瘤細胞株的方法，包括如下步驟：

(1)制備6碳三聚氰胺-載體蛋白藕聯物，所述載體蛋白為鑰孔嘁血藍蛋白、牛血清蛋白或卵清蛋白，所述6碳三聚氰胺的結構如下

(2)動物免疫

以步驟1所述6碳三聚氰胺-載體蛋白藕聯物為免疫原免疫小鼠，取免疫后小鼠的血清，檢測該血清抗三聚氰胺的效價和抑制價，選取效價和抑制價最高的免疫小鼠；

(3)細胞融合

取步驟(2)所得免疫小鼠的脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合、培養；

(4)雜交瘤細胞株的篩選

檢測各融合細胞培養后的上清液的抗體效價及抑制價，選取抗體效價及抑制價最高的命名為三聚氰胺特異性淋巴細胞雜交瘤株B-4B5-F10-B11。

本發明還提供所述雜交瘤細胞株分泌的抗三聚氰胺單克隆抗體。

所述抗三聚氰胺單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

(1)腹水的制備：

將所述雜交瘤細胞株注入baleb/c雌性小鼠腹腔，5-7后天產生腹水；取腹水上清；

(2)抗三聚氰胺單克隆抗體的純化：

初步純化：所述腹水上清經飽和硫酸胺沉淀，取沉淀溶解后透析，獲得抗三聚氰胺單克隆抗體粗品；

Protein?G親和層析純化：將抗三聚氰胺單克隆抗體粗品經Protein?G親和層析柱進行純化，收集吸收峰，即為抗三聚氰胺單克隆抗體。

本發明所述抗三聚氰胺單克隆抗體可以應用于三聚氰胺的定性或定量檢測。

本發明還提供一種利用權力要求3所述抗三聚氰胺單克隆抗體檢測檢測三聚氰胺的試劑盒，該試劑盒的組成如下：

(1)用6碳三聚氰胺-OVA藕聯物的碳酸鹽緩沖液包被過的酶標板；

(2)HRP標記的抗三聚氰胺單克隆抗體溶液；

(3)TMB顯色劑：TMB濃度是0.3g/L；

(4)終止液：濃度為2M的H₂SO₄；

(5)三聚氰胺標準液：濃度分別為0，0.5，1.5，4.5，13.5，40.5μg/L的三聚氰胺標準液。