[發(fā)明專利]甾體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器及構(gòu)建方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010595059.1
• 申請(qǐng)日: 2010-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN102128938A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于源華;宋禹;于化東;何秀霞;張淑華;葛淑敏;馬書林;侯巍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長(zhǎng)春理工大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/74
• 分類號(hào): G01N33/74;G01N21/64;C12N15/70;C12N15/65
• 代理公司: 長(zhǎng)春眾益專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀(jì)尚

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)，天然、人工合成的甾體類及多環(huán)芳烴化合物無(wú)限制的排放到自然環(huán)境中，這類污染物的激素活性及對(duì)生物體的消極影響倍受人們關(guān)注。由于其分布廣泛，在極低的濃度下都具有激素活性，對(duì)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，所以能夠靈敏、快速、高效的檢測(cè)甾體類及多環(huán)芳烴化合物的新技術(shù)亟待發(fā)展。目前傳統(tǒng)的檢測(cè)分析技術(shù)主要是氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(HC-MS)，另外國(guó)內(nèi)外專家基于人體甾體激素受體的研究已研制成多種甾體類激素檢測(cè)系統(tǒng)。這些檢測(cè)系統(tǒng)大多數(shù)需要人體或酵母細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高，此外還存在靈敏度低、只能檢測(cè)一種化合物等弊端，因此將這些技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)方面是極為有限的。

睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni，C.T)的顯著特性是其具有特異性降解甾體類及多環(huán)芳烴化合物酶基因，并且已有關(guān)于其降解甾體類及多環(huán)芳烴化合物基因表達(dá)與甾體類激素和多環(huán)芳烴化合物應(yīng)答機(jī)制的研究。是否可以用C.T以甾體類及多環(huán)芳烴化合物為信號(hào)體系，構(gòu)建一種敏感、快速、簡(jiǎn)單的生物傳感器，用來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的甾體類及多環(huán)芳烴化合物混合物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是：提供一種甾體類激素及多環(huán)芳烴高效生物熒光傳感器及構(gòu)建方法，將質(zhì)粒pK-3α-GFP3和p6分別轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中，建立了一種綠色熒光蛋白標(biāo)記的生物熒光檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)對(duì)象為甾體類激素和多環(huán)芳烴兩大類物質(zhì)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

本發(fā)明構(gòu)建了基于睪丸酮叢毛單胞菌(C.testosteroni，C.T)的甾體類激素及多環(huán)芳烴生物熒光檢測(cè)系統(tǒng)。睪丸酮叢毛單胞菌能夠以睪丸酮等甾體類激素作為唯一碳源和能源，還能降解非固醇類的多環(huán)芳烴等物質(zhì)，通過(guò)3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)等酶的代謝，消化這類底物。綠色熒光蛋白(GFP)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)標(biāo)記領(lǐng)域的報(bào)告基因，其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色熒光，根據(jù)其熒光強(qiáng)度通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出特異底物的相對(duì)含量。

本發(fā)明將質(zhì)粒pK-3α-GFP3和p6分別轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中并分別制備成非細(xì)胞體系檢測(cè)試劑，建立了一種綠色熒光蛋白標(biāo)記的生物熒光檢測(cè)系統(tǒng)。在重組質(zhì)粒pK-3α-GFP3的順勢(shì)β-半乳糖苷酶(LacZ)啟動(dòng)子基因(見序列1)下游依次插入了3α-HSD啟動(dòng)子等調(diào)控序列(見序列2)470堿基對(duì)及GFP報(bào)告基因(見序列3)717堿基對(duì)；重組質(zhì)粒p6含有3α-HSD全部調(diào)控基因(見序列4)，共5257堿基對(duì)。當(dāng)環(huán)境中存在雌激素等底物時(shí)，可以誘導(dǎo)p6質(zhì)粒上3α-HSD的調(diào)控序列表達(dá)調(diào)控作用的蛋白，該蛋白可使質(zhì)粒pK-3α-GFP3上的啟動(dòng)子啟動(dòng)進(jìn)而表達(dá)出GFP蛋白，此時(shí)GFP的表達(dá)量嚴(yán)格受到誘導(dǎo)底物量的控制。

質(zhì)粒pK-3α-GFP3中順勢(shì)LacZ啟動(dòng)子基因能夠作用于其本身質(zhì)粒中的3α-HSD的調(diào)控序列和啟動(dòng)子基因，促進(jìn)其后的綠色熒光蛋白大量表達(dá)，對(duì)熒光信號(hào)具有放大、增強(qiáng)作用。根據(jù)該熒光傳感器的熒光強(qiáng)度大小，通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出特異性底物的相對(duì)含量。

本發(fā)明的構(gòu)建方法是：

(1)質(zhì)粒pK-3α-GFP3轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)12至14小時(shí)，將培養(yǎng)后大腸桿菌按體積比1∶20接種于培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)后菌液離心，棄上清，加入無(wú)菌水洗滌菌體，離心棄上清，重復(fù)洗滌兩次，加入無(wú)菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20℃至25℃反復(fù)凍融三次，離心，取上清即為制備的非細(xì)胞體系細(xì)胞漿(-20℃可保存一個(gè)月)。

(2)將質(zhì)粒p6轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)12至14小時(shí)，將培養(yǎng)后大腸桿菌按體積比1∶20接種于培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)，將培養(yǎng)后菌液離心，棄上清，加入無(wú)菌水洗滌菌體，離心棄上清，重復(fù)洗滌兩次，加入無(wú)菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20℃至25℃反復(fù)凍融三次，離心，取上清即為制備的非細(xì)胞體系細(xì)胞漿(-20℃可保存一個(gè)月)。

(3)將質(zhì)粒pK-3α-GFP3的非細(xì)胞體系細(xì)胞漿與質(zhì)粒P6的非細(xì)胞體系細(xì)胞漿分別測(cè)定蛋白含量并分別制備成蛋白含量＝0.1mg/mL的工作液，兩種工作液按體積比1～2∶1～10混合。應(yīng)用此混合非細(xì)胞體系構(gòu)建高效生物熒光傳感器。

建立生物熒光標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線

(1)將檢測(cè)底物標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)水乙醇溶解，分別配制濃度為10^-3M、10^-6M、10^-9M、10^-12M、10^-15M/L的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)液。