[發明專利]甾體類激素及多環芳烴高效生物熒光傳感器及構建方法

無效

• 申請號: 201010595059.1
• 申請日: 2010-12-20
• 公開（公告）號: CN102128938A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 于源華;宋禹;于化東;何秀霞;張淑華;葛淑敏;馬書林;侯巍
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74;G01N21/64;C12N15/70;C12N15/65
• 代理公司: 長春眾益專利商標事務所(普通合伙) 22211
• 代理人: 紀尚

1.一種甾體類激素及多環芳烴高效生物熒光傳感器，其特征是：將質粒pK-3α-GFP3和p6分別轉化進大腸桿菌中并分別制備成非細胞體系檢測試劑，建立了一種綠色熒光蛋白標記的生物熒光檢測系統；在重組質粒pK-3α-GFP3的順勢β-半乳糖苷酶啟動子基因下游依次插入了3α-HSD啟動子等調控序列470堿基對及GFP報告基因717堿基對；重組質粒p6含有3α-HSD全部調控基因，共5257堿基對；當環境中存在雌激素等底物時，可以誘導p6質粒上3α-HSD的調控序列表達調控作用的蛋白，該蛋白可使質粒pK-3α-GFP3上的啟動子啟動進而表達出GFP蛋白，此時GFP的表達量嚴格受到誘導底物量的控制。

2.一種甾體類激素及多環芳烴高效生物熒光傳感器的構建方法，其構建方法是：

a、質粒pK-3α-GFP3轉化到大腸桿菌中，培養12至14小時，將培養后大腸桿菌按體積比1∶20接種于培養基中，擴大培養，將培養后菌液離心，棄上清，加入無菌水洗滌菌體，離心棄上清，重復洗滌兩次，加入無菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20℃至25℃反復凍融三次，離心，取上清即為制備的非細胞體系細胞漿；

b、將質粒p6轉化到大腸桿菌中，培養12至14小時，將培養后大腸桿菌按體積比1∶20接種于培養基中，擴大培養，將培養后菌液離心，棄上清，加入無菌水洗滌菌體，離心棄上清，重復洗滌兩次，加入無菌水及溶菌酶，重懸菌體，-20℃至25℃反復凍融三次，離心，取上清即為制備的非細胞體系細胞漿；

c、將質粒pK-3α-GFP3的非細胞體系細胞漿與質粒P6的非細胞體系細胞漿分別測定蛋白含量并分別制備成蛋白含量＝0.1mg/mL的工作液，兩種工作液按體積比1～2∶1～10混合；應用此混合非細胞體系構建高效生物熒光傳感器；

d、將檢測底物標準品用無水乙醇溶解，分別配制濃度為10^-3M、10^-6M、10^-9M、10^-12M、10^-15M/L的標準檢測液；

f、取非細胞體系檢測試劑分別加入標準檢測液，空白對照加入無水乙醇，靜置，用熒光酶標儀檢測其熒光發光值，建立標準檢測曲線。

3.根據權利要求1所述的一種甾體類激素及多環芳烴高效生物熒光傳感器，其特征是：質粒pK-3α-GFP3中順勢LacZ啟動子基因能夠作用于其本身質粒中的3α-HSD的調控序列和啟動子基因，促進其后的綠色熒光蛋白大量表達，對熒光信號具有放大、增強作用。

4.根據權利要求1所述的一種甾體類激素及多環芳烴高效生物熒光傳感器，其特征是：根據該熒光傳感器的熒光強度大小，通過對照標準曲線計算出特異性底物的相對含量。

5.根據權利要求1所述的一種甾體類激素及多環芳烴高效生物熒光傳感器，其特征是：檢測對象是甾體類激素和多環芳烴兩類物質，樣品檢測濃度范圍為10^-15至10^-3摩爾每升。