[發明專利]誘導性多能干細胞的制備方法以及用于制備誘導性多能干細胞的培養基

無效

• 申請號: 201010594842.6
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102559587A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 謝欣;王荃
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海藥物研究所
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京金信立方知識產權代理有限公司 11225
• 代理人: 朱梅;劉曄

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及誘導性多能干細胞的制備方法以及用于制備誘導性多能干細胞的培養基。

背景技術

胚胎干細胞來源于早期胚胎的內細胞團，在體外培養中能夠自我更新、保持多能性并具有向三個胚層細胞分化的能力。隨著1981年小鼠胚胎干細胞和1998年人的胚胎干細胞的建系成功[1，2]，再生醫學的研究真正地拉開了序幕。胚胎干細胞的應用前景主要是用于移植治療，以胚胎干細胞作為起始細胞，通過體外培養及定向分化，可以為臨床治療提供大量的組織和器官的移植材料。通過對于胚胎干細胞自我更新和定向分化機制的研究，許多特異性的細胞類型(例如，神經細胞、心肌細胞等)已經具備了成熟的分化方法的檢測標準，這些研究為帕金森氏病、老年癡呆癥、心肌損傷、糖尿病、肝硬化等疾病的治療帶來了希望。然而，胚胎干細胞真正從體外研究到進入臨床應用還面臨許多技術和倫理問題，比如，如何獲得無免疫排斥的胚胎干細胞？如何獲得病人自身的胚胎干細胞？等等。

2006年，Yamanaka實驗室首先報道可以利用過表達Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種轉錄因子使小鼠的成纖維細胞逆分化成具有胚胎干細胞特性的細胞，并將其命名為誘導性多能干細胞(Induced?Pluripotent?Stem?Cells，iPSCells)[3]。在這篇發表在《Cell》雜志上的文章中，研究人員最初是選取了24個與胚胎干細胞信號調控相關的基因作為候選基因，以逆轉錄病毒為基因轉染載體，用混合有多種不同基因的病毒感染小鼠成纖維細胞，最終以細胞形態學特征、胚胎干細胞特定基因的表達以及畸胎瘤的形成等指標作為iPS細胞多能性的鑒定指標。他們在實驗中最終將24個候選基因減少到Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc這四個轉錄因子。雖然在這篇文章中，研究人員最終沒有得到嵌合體小鼠，但是直接從已分化的細胞得到干細胞為胚胎干細胞領域甚至生命科學領域都帶來了概念性的革新。iPS細胞誘導技術的出現也引起了人們對其生物醫學應用的極大關注，因為我們可以病人的體細胞為來源得到病人特異的iPS細胞，這種iPS細胞又可以分化為具有功能的細胞、組織和器官，用于疾病治療。這樣的應用方式可以避免免疫相容性和倫理問題。

2007年，三個不同的實驗室均發表文章報道獲得了具有種系嵌合能力的小鼠iPS細胞[4-6]。在此之后，也陸續有實驗室報道獲得了人的iPS細胞[7，8]。2009年，研究人員首次利用iPS細胞通過四倍體囊胚注射得到存活并具有繁殖能力的小鼠，證明了iPS細胞具有真正的全能性[9]。iPS作為誘導產生多能性干細胞的一種技術，在臨床疾病治療方面的應用價值是巨大的，因為它不像傳統的核移植或者細胞融合等獲取干細胞的方式那樣需要人的卵子或人的胚胎干細胞，并且它由成體細胞重編程為干細胞的特性避免了免疫排斥使得自體移植變得更加可行；另一方面，iPS對于干細胞自我更新機制的研究、干細胞信號調控的研究以及很多疾病的研究都有很大意義。

但是，iPS細胞的應用仍然有兩大問題，安全問題和誘導效率問題。在生物安全問題方面，最初實驗體系中過表達的外源基因中含有兩個癌基因(c-Myc和Klf-4)，并且外源基因的導入方式是逆轉錄病毒，病毒在基因組中有多個拷貝的插入也會導致基因突變及癌變。因此，研究人員正在致力于優化iPS技術使其應用的安全性增加，例如，減少轉錄因子的數目[10，11]，或者使用非整合到基因組的基因轉染方法[12]，還有直接添加透膜的轉錄因子蛋白的形式進行重編程[13]。但是，這些方法會導致iPS細胞的誘導效率更加低下，目前iPS細胞的形成效率一般都低于1％，這對iPS細胞的發展和應用造成了巨大障礙。因此，尋找能夠提高iPS細胞誘導效率的培養條件、方法或小分子化合物，對推動iPS細胞的基礎研究和臨床應用將有巨大幫助。

發明內容

因此，針對現有技術中存在的問題，本發明人進行了廣泛和深入的研究，最終完成本發明。

為了提高iPS細胞的誘導效率，本發明提供了一種誘導性多能干細胞的制備方法，該方法包括以下步驟：

步驟1，將一個或多個干細胞多能性因子導入體細胞；

步驟2，使用添加了鋰鹽的培養基培養步驟1中導入了干細胞多能性因子的體細胞；以及

步驟3，鑒定誘導性多能干細胞克隆。

優選地，所述方法進一步包括將報告基因導入體細胞以此通過報告基因來指示所述誘導性多能干細胞的產生及其產生效率。且更優選地，所述報告基因為Oct4-GFP或Nanog-GFP，且更優選為Oct4-GFP。