[發明專利]誘導性多能干細胞的制備方法以及用于制備誘導性多能干細胞的培養基

無效

• 申請號: 201010594842.6
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102559587A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 謝欣;王荃
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海藥物研究所
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 北京金信立方知識產權代理有限公司 11225
• 代理人: 朱梅;劉曄

1.一種誘導性多能干細胞的制備方法，該方法包括以下步驟：

步驟1，將一個或多個干細胞多能性因子導入體細胞；

步驟2，使用添加了鋰鹽的培養基培養步驟1中導入了干細胞多能性因子的體細胞；以及

步驟3，鑒定誘導性多能干細胞克隆。

2.根據權利要求1所述的方法，其中，進一步包括將報告基因導入體細胞，以此報告基因來指示所述誘導性多能干細胞的產生及其產生效率。

3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述報告基因為Oct4-GFP或Nanog-GFP，且優選為Oct4-GFP。

4.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟1中，所述干細胞多能性因子選自Oct4、Sox2、Sox1、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog、c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28和Esrrb中。

5.根據權利要求4所述的方法，其中，在步驟1中，所述干細胞多能性因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，或者包括Oct4、Sox2和Klf4。

6.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述鋰鹽包括氯化鋰、碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鋰、門東氨酸鋰、γ亞麻酸鋰、肝素鋰、硫酸鋰、硝酸鋰及其它包含鋰離子的化學品。

7.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述鋰鹽為氯化鋰。

8.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述鋰鹽的工作濃度為0.1-40mM，且優選為0.5-20mM，更優選為5-10mM，最優選為10mM。

9.根據權利要求1所述的方法，其中，在步驟2中，所述培養基為mES培養基和KSR培養基，所述mES培養基為添加有15％胎牛血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β-巰基乙醇的DMEM，且所述KSR培養基為添加有15％替代血清、1000U/mL白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/鏈霉素和β-巰基乙醇的Knockout?DMEM。

10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述步驟2進一步包括：將步驟1中制備的導入了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四因子或Oct4、Sox2、Klf4三因子的小鼠胚胎成纖維細胞在第二天消化并接種到飼養層細胞中使用mES培養基培養，并在第三天使用添加了鋰鹽的mES培養基培養，在第六天換為添加鋰鹽的KSR培養基培養，在第八天換為KSR培養基繼續培養；以及挑選具有良好干細胞形態或Oct4-GFP陽性的克隆進行傳代。

11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述體細胞來自哺乳動物的體細胞。

12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔、豬、羊、牛、猴或人。

13.一種用于制備誘導性多能干細胞的培養基，其進一步包含鋰鹽。

14.根據權利要求13所述的培養基，其中，所述鋰鹽包括氯化鋰、碳酸鋰、醋酸鋰、溴化鋰、門東氨酸鋰、γ亞麻酸鋰、肝素鋰、硫酸鋰、硝酸鋰及其它包含鋰離子的化學品。

15.根據權利要求13所述的培養基，其中，所述鋰鹽為氯化鋰。

16.根據權利要求13所述的培養基，其中，所述鋰鹽的工作濃度為0.1-40mM，且優選為0.5-20mM，更優選為5-10mM，最優選為10mM。

17.根據權利要求12所述的培養基，其中，所述培養基為添加了鋰鹽的mES培養基和添加了鋰鹽的KSR培養基。