[發明專利]一種制備酶標記抗體的方法

無效

• 申請號: 201010594301.3
• 申請日: 2010-12-19
• 公開（公告）號: CN102141567A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發明（設計）人: 吳堅;李冬陽;應義斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/532
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

技術領域

本發明屬于免疫分析技術領域，尤其涉及一種酶標記抗體的制備方法。

背景技術

酶免疫測定技術自問世以來發展迅速，在藥物篩選、醫療診斷、食品安全檢測等眾多領域得到廣泛應用。它既繼承了放射性免疫測定的高靈敏度等優點，又克服了前者需使用放射性標記這一缺點。酶免疫測定將酶促反應的高效率和免疫反應的高特異性有機地結合起來，可對各種分析物如蛋白、毒素、農藥、微生物等進行定量檢測，是目前靈敏度高、適應性強、并在生產和臨床中得到推廣的免疫測定技術。另外，在免疫測定中使用酶作為標記，還在于酶能保持長期的穩定性、對操作人員無危害、并避免了放射性免疫中存在的廢物處理問題。而制備特定抗體和酶偶聯物（酶標記抗體）是能否實現對特定抗原分析物進行定量檢測的關鍵。

目前用于酶標記抗體制備的方法傳統的主要有戊二醛法和過碘酸鈉法。戊二醛法也是至今最常見的標記酶到抗體上的偶聯方法。它又分為一步法和兩步法，一步法操作簡便、快速，只要將一定量的酶和抗體加入到緩沖液中，同時加入一定量的戊二醛進行反應。但一步法的缺點是（1）偶聯反應不易控制，若被偶聯的兩種物質與偶聯劑的反應速度不同，則反應速度快的那種分子易發生自生聚合；（2）偶聯效率不高，參與偶聯反應的兩種分子所占比率較低。而兩步法克服了一步法的缺點，它采用將與偶聯劑反應較弱的分子先用過量的偶聯劑活化，然后去除多余偶聯劑后再加入反應速度相對快的偶聯分子。兩步法雖然操作繁瑣，但偶聯率提高，而且形成的同分子聚合物減少。過碘酸鈉法是偶聯酶和糖蛋白產率最高的方法，該法利用過碘酸鈉將糖蛋白（抗體、糖基化的酶等）上的糖鏈基團氧化成醛基，再通過醛基與待偶聯的分子發生連接。與戊二醛法相比，過碘酸鈉法的效率提高至少3～4倍。用于偶聯HRP和IgG時，約有70%的酶和99%的抗體反應。最佳時，每個IgG分子可與5～6個HRP分子連接。盡管按該法制備酶標記物時酶活的損失可達50%，但用于酶免疫測定時可將靈敏度提高5倍左右。過碘酸鈉法雖有很高的產率，但操作中對于過碘酸鈉的濃度和工作pH等都需十分注意，過碘酸鈉濃度過高可以導致新形成的醛基被直接進一步氧化為羧基，濃度過低則無法使糖基氧化。針對不同批次的酶之間存在糖基化程度有差別的特點，使用過碘酸鈉法時需對不同批次的方法有所調整。另一方面，由于重組抗體和許多單克隆抗體不含糖基，若準備用該法連接這類抗體時，需事先確定抗體上是否有合適的修飾位點。戊二醛法和過碘酸鈉法各有優點，也成為了商業法酶標抗體（如Sigma公司）的主流制備方法，但這兩種方法都涉及使用高濃度的酶和抗體，也需要較為繁瑣的分離與純化步驟，如凝膠過濾、長時間透析或親和層析柱純化等。

近年來，納米技術發展迅速，新興的納米材料也層出不窮，這為新一代的酶標抗體的發展提供了可能。西班牙Merkoci課題組分別于2007年和2010年報道將HRP二抗和膠體金結合形成膠體金HRP二抗復合標記抗體用于酶聯免疫檢測，結果表明新的酶標抗體能使檢測的靈敏度提高10倍左右。該復合抗體是將傳統方法制備的酶標記抗體以膠體金表面能承受的飽和吸附量吸附到膠體金表面，形成包被有酶標二抗的納米膠體金。當膠體金上的任一抗體參與抗原捕捉后，與該抗體連接著的膠體金上的其他酶標記抗體都可以參與信號示蹤（如加底物后顯色），從而使靈敏度提升。另一方面，膠體金的相對大的表面積足以同時容納更多的酶標記抗體（如1個18nm膠體金離子可容納約13個HRP），Merkoci課題組使用的這種高靈敏度的膠體金復合酶標特點在于使參與信號示蹤的酶標量增多，突破傳統酶標抗體在參與捕捉抗原后，只有酶標抗體其自身所帶1～2倍數量酶標分子能參與信號示蹤這一局限。該膠體金復合酶標記抗體雖有更高的靈敏性，但是仍以制備好的傳統酶標抗體為基礎，并沒變傳統意義上抗體與酶的偶聯過程。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種制備酶標記抗體的方法，能以未經偶聯的抗體和酶為基礎，結合納米材料（膠體金）制備高靈敏度的新一代酶標記膠體金復合抗體。為此，本發明采用以下技術方案：它將膠體金溶液濃縮，然后將濃縮后的膠體金溶液的pH調到略高于用于標記的酶的等電點的pH，將用于標記的酶的水溶液加入膠體金溶液后混勻，再通過雙功能試劑將抗體連接到膠體金表面的酶分子上，經離心后即制得酶標記金膠復合抗體。