[發(fā)明專利]一種制備酶標記抗體的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010594301.3
• 申請日: 2010-12-19
• 公開（公告）號: CN102141567A
• 公開（公告）日: 2011-08-03
• 發(fā)明（設計）人: 吳堅;李冬陽;應義斌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/532
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于它將膠體金溶液濃縮，然后將濃縮后的膠體金溶液的pH調到略高于用于標記的酶的等電點的pH，將用于標記的酶的水溶液加入膠體金溶液后混勻，再通過雙功能試劑將抗體連接到膠體金表面的酶分子上，經(jīng)離心后即制得酶標記金膠復合抗體。

2.如權利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述用于標記的酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。

3.如權利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所采用膠體金粒子的直徑范圍在18～60nm之間。

4.如權利要求1、2或3所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述略高于用于標記的酶的等電點的pH為高于用于標記的酶的等電點0.4-0.6個單位的pH。

5.如權利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述雙功能試劑為戊二醛或N,N'-二琥珀酰亞胺碳酸酯。

6.如權利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述方法包括制備用于標記的酶溶液的步驟，它將用于標記的酶用水配成0.1～2mg/mL的澄清溶液，所述用于標記的酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶；

所述方法還包括制備膠體金溶液的步驟，所述膠體金溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸的方法來制備；

所述方法還包括以下步驟：

(1)?將所制備的膠體金溶液濃縮至原濃度的2倍，將濃縮過的膠體金溶液的pH值調節(jié)到適合標記酶的最佳pH范圍，即高出用于標記的酶的等電點約0.4-0.6個單位的pH，然后將該膠體金溶液與所述用于標記的酶溶液進行混合，在室溫或4°C條件下混合1h；

隨后將混合液于15000g?4°C下離心15min，吸走上清液后加入等體積的磷酸鹽緩沖液重新溶解，所述磷酸鹽緩沖液的pH?=7.4，即得到標記有酶的膠體金溶液；

(2)?將步驟(1)所得溶液中加入雙功能試劑，所述雙功能試劑選自如戊二醛或N,N'-二琥珀酰亞胺碳酸酯，使標記在膠體金上的酶經(jīng)雙功能試劑活化后修飾上功能基團；隨后將反應液在15000g?4°C下進行離心，離心后吸走上清液并加入等體積的磷酸鹽緩沖液重新溶解，所述磷酸鹽緩沖液的pH?=7.4，此離心步驟重復進行以去除未參與反應的多余雙功能試劑；

?(3)?往步驟(2)所得的產(chǎn)物中加入抗體，抗體的最終濃度為5～50μg/mL，混勻后過夜反應，使抗體連接到標記在膠體金上的酶的活化的功能基團上，隨即加入封閉劑封閉掉酶上可能殘余的雙功能試劑功能基團；然后將產(chǎn)物進行離心后溶于磷酸鹽緩沖液中，即制得以膠體金為載體的酶標記抗體。