[發明專利]一種新的犬新孢子蟲速殖子的體外培養和染色方法

無效

• 申請號: 201010593980.2
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN102533556A
• 公開（公告）日: 2012-07-04
• 發明（設計）人: 李建華;呂強;張西臣;宮鵬濤;張楠;楊舉;李赫;張國才
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12Q1/02
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

技術領域

本發明涉及了一種新的犬新孢子蟲速殖子的體外培養和染色方法，屬于生命科學領域。

背景技術

犬新孢子蟲是一種胞內寄生性原蟲，形態與龔地弓形蟲相似，在其全部生活史中可出現數種不同的形態,即速殖子、包囊、卵囊等。它可引起妊娠母畜的流產和死胎，使新生兒患有嚴重的精神性疾病，給畜牧業造成了巨大的經濟損失，危害嚴重，但迄今尚無理想的防治辦法，究其原因就是新孢子蟲速殖子在體外較難培養，并且由于速殖子體積較小，在細胞內生長時如果不利用染色方法不容易被觀察到或被誤診，而且目前尚沒有簡單實用的新孢子蟲胞內速殖子的染色方法，這不利于該病的快速檢測，同時也限制了該病疫苗的研究。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種新的犬新孢子蟲速殖子（N.C-1株）的體外培養和染色方法，其培養方法以MCF-7乳腺癌細胞為宿主細胞，當培養成單層細胞細胞后，接種犬新孢子蟲速殖子，利用RPIM-1640培養基進行培養，該培養方法簡單實用，且培養效果較好。

本發明另一目的在于同時提供了一種新的犬新孢子蟲速殖子的染色方法，該方法利用吖啶橙進行染色，染色結束后利用普通熒光顯微鏡即可對染色結果進行觀察，整個染色方法操作簡便，并且操作時間較短，這對于該病的快速診斷有很高的價值。

本發明的技術方案是這樣實現的：犬新孢子蟲速殖子的培養方法，其特征在于培養的具體步驟為：首先常規培養MCF-7乳腺癌細胞，當其長成細胞單層后，按10⁴/ml?接種1ml犬新孢子蟲；之后用含2%胎牛血清的RPIM-1640培養基進行培養，每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數目，可看到胞外新孢子蟲速殖子的數目從第2天開始緩慢增長，自第3天開始迅速增長，在第4天即可達到頂峰，在第五天顯著下降。

所述的犬新孢子蟲速殖子的染色采用胞內速殖子吖啶橙染色，其具體步驟為：新孢子蟲速殖子經多聚甲醛固定，吖啶橙染色后經普通熒光顯微鏡照相觀察；MCF-7細胞感染新孢子蟲速殖子后，在第三天和第五天分別進行吖啶橙染色；經熒光顯微鏡觀察，在第三天細胞內可直觀、清晰地看到大量的速殖子，在第五天可看到細胞和速殖子均顯著減少。

本發明的積極效果在于該培養方法簡單實用，可快速培養新孢子蟲速殖子，并且經吖啶橙染色后利用普通熒光顯微鏡即可快速、直觀、清晰的觀察到胞內寄生蟲。

本培養方法與目前常用的培養新孢子蟲速殖子的vero細胞相比，可快速大量的培養新孢子蟲速殖子。在同等培養條件下，新孢子蟲速殖子的數目比在vero細胞中可早一天達到頂峰，并且達到頂峰后速殖子的數目與在vero細胞中頂峰時的數目相當，表明MCF-7細胞更適于新孢子蟲速殖子的生長。每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數目，可看到胞外新孢子蟲速殖子的數目從第2天開始增長，直到第五天胞外速殖子的數目才達到頂峰。并且在第六天時新孢子蟲速殖子的數目迅速下降。因此，MCF-7細胞更適于培養新孢子蟲速殖子，從而為新孢子蟲的相關研究打下堅實的基礎。

?????目前，尚沒有新孢子蟲速殖子染色方法的報道，本發明填補了這一研究空白，從而為新孢子蟲病的診斷提供了一種快速有效的方法。

如圖1所示每天利用倒置顯微鏡觀察胞外新孢子蟲速殖子的數目，連續觀察6天，可看到胞外新孢子蟲速殖子的數目從第2天開始緩慢增長，自第3天開始迅速增長，在第4天達到頂峰，在第五天顯著下降。

如圖2所示新孢子蟲速殖子在MCF-7細胞和vero細胞中生長曲線的比較（在相同條件下），可看出在MCF-7細胞中，新孢子蟲速殖子的數目在第4天即可達到頂峰，并且高峰期可持續一天，而在vero細胞中第5天才達到頂峰，達到頂峰后速殖子的數目迅速減少，表明MCF-7細胞更適于培養新孢子蟲速殖子，可作為培養新孢子蟲速殖子的新的宿主細胞。

如圖3所示，利用普通熒光顯微鏡觀察MCF-7細胞的胞內新孢子蟲速殖子（900×）,MCF-7細胞感染新孢子蟲速殖子后，在第三天和第五天吖啶橙染色。在488nm下DNA呈綠色，在568nm下RNA呈紅色。第三天在細胞內可看到大量的速殖子，在第五天可看到細胞和速殖子均顯著減少（A為第三天的胞內速殖子，B為第五天的胞內速殖子，右邊為相應的對照組）。

附圖說明

圖1為MCF-7細胞胞外新孢子蟲速殖子的生長曲線。

圖2為本發明新孢子蟲速殖子在MCF-7細胞和vero細胞中生長曲線的比較圖。

圖3為本發明實驗效果圖。

具體實施方式

實施例1