[發(fā)明專利]檢測RNA分子的方法、試劑盒及其相關(guān)用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010593975.1
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN102102130A
• 公開（公告）日: 2011-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A.阿爾伯斯;W.安肯鮑爾;F.貝格曼;S.弗羅納;D.海因德爾
• 申請（專利權(quán)）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;郭文潔

技術(shù)領(lǐng)域

第一方面，本發(fā)明涉及檢測RNA分子的方法，所述方法包括以下步驟：提供含有所述RNA分子的樣品；將第一多核苷酸與所述RNA分子雜交；延伸所述第一多核苷酸以產(chǎn)生第一鏈cDNA；將第二多核苷酸與所述第一鏈cDNA雜交，其特征在于所述第二多核苷酸是3′-不可延伸的寡核苷酸；延伸所述第一鏈cDNA以產(chǎn)生延伸反應(yīng)產(chǎn)物；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增所述延伸反應(yīng)產(chǎn)物；以及通過實時熒光讀出（real-time?fluorescence?readout）檢測擴增產(chǎn)物。另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，所述試劑盒包含如本發(fā)明所定義的第一和第二多核苷酸、一組dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和檢測部分。還另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的所述試劑盒用于檢測RNA分子的用途。

背景技術(shù)

RNA分子在多種生物的基因表達中發(fā)揮重要作用。最近，發(fā)現(xiàn)小RNAs是轉(zhuǎn)錄后基因表達，特別是基因沉默的重要調(diào)節(jié)子，對活細胞中的生理和病理過程有影響。由小RNAs引導(dǎo)的基因沉默過程首先于1993年在線蟲類（nematode）秀麗新桿線蟲（Caenorhabditis?elegans）中發(fā)現(xiàn)。在其中，顯示lin-4?基因的21-nts長的非編碼RNA?轉(zhuǎn)錄物介導(dǎo)稱為lin-41的靶基因的抑制。這種抑制顯示為依賴于短lin-4?RNA分子和源自lin-41基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的3′-非翻譯區(qū)(UTR)之間的互補堿基配對。從那時起，已發(fā)現(xiàn)短RNAs是植物、動物和DNA病毒中一類豐富的基因調(diào)節(jié)子，已在從裂殖酵母到人類的多種生物中鑒定了不同來源和功能的短RNAs。短調(diào)節(jié)RNAs的種類包含例如miRNA(微RNA)、siRNA(小干擾RNA)、piRNA?(Piwi-相互作用RNA)以及rasiRNA?(重復(fù)相關(guān)小干擾RNA)。在它們之中，miRNAs是植物和動物中最豐富類型的小調(diào)節(jié)RNAs。例如，大約3?%的人類基因編碼miRNAs，最多30?%的人類蛋白編碼基因被認為由miRNAs調(diào)節(jié)。迄今，通過克隆和測序已鑒定出大于10.000種不同的miRNAs(參見，例如，miRBase:?the?microRNA?registry?database?at?http://www.mirbase.org/，Sanger?Institute，UK)。一般而言，miRNAs的特征為21-25個核苷酸(nts)的長度并由長度大約為70個核苷酸的較長內(nèi)源發(fā)夾轉(zhuǎn)錄物（稱為前體-miRNAs或pre-miRNAs）加工而來。對于lin-4?RNA的情況，已顯示miRNAs通過在miRNA和它的靶mRNA之間形成互補堿基對的機制來調(diào)節(jié)蛋白表達。該過程引起蛋白翻譯的抑制，并且，根據(jù)miRNA與它的靶位點之間序列互補的程度，引起mRNA轉(zhuǎn)錄物的降解?(綜述參見，例如，Bartel，2009)。

改變的miRNA表達已顯示出導(dǎo)致人類疾病，特別是癌癥，這是基于與正常組織相比，惡性腫瘤和腫瘤細胞系顯示失調(diào)的miRNA表達概況的發(fā)現(xiàn)(綜述參見，例如，Sassen等人，2008)。即，在人類癌癥中已觀察到miRNA水平的總體降低，這表明小調(diào)節(jié)RNAs可能在腫瘤抑制中具有內(nèi)在功能。Lu等人?(2005)通過在334種人類癌癥、癌癥細胞系和正常組織中分析總計217種人類和小鼠miRNAs，首次顯示：與相應(yīng)正常組織相比，許多miRNAs的表達水平在癌癥中顯著降低。這些作者發(fā)現(xiàn)癌癥伴隨顯著降低的總體miRNA表達，并且與分化較高的腫瘤相比，分化較差的腫瘤顯示較低miRNA水平。另一項最近的研究檢測了241種人類miRNAs在人類癌癥細胞系的綜合組（comprehensive?panel）、NCI-60組，和正常組織中的表達，并且證實了與相應(yīng)正常組織相比，大部分miRNAs在源自人類腫瘤的細胞系中以較低水平表達的發(fā)現(xiàn)?(Gaur等人，2007)。