[發(fā)明專利]檢測(cè)RNA分子的方法、試劑盒及其相關(guān)用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010593975.1
• 申請(qǐng)日: 2010-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN102102130A
• 公開（公告）日: 2011-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A.阿爾伯斯;W.安肯鮑爾;F.貝格曼;S.弗羅納;D.海因德爾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 霍夫曼－拉羅奇有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李波;郭文潔

1.檢測(cè)RNA分子的方法，所述方法包括以下步驟：

a)?提供含有所述RNA分子的樣品；

b)?將包含第一引物結(jié)合位點(diǎn)的第一多核苷酸與所述RNA分子雜交；

c)?通過逆轉(zhuǎn)錄所述RNA分子的序列延伸所述第一多核苷酸以產(chǎn)生第一鏈cDNA；

d)?將第二多核苷酸與所述第一鏈cDNA雜交，其中所述第二多核苷酸是3′-不可延伸的寡核苷酸，其包含

(i)?3′-部分，其與所述第一鏈cDNA的一部分互補(bǔ)，以及

(ii)?5′-突出端，其包含第二引物結(jié)合位點(diǎn)的序列；

并且其中所述第二多核苷酸包含至少一個(gè)或幾個(gè)dU核苷酸殘基；

e)?在不存在dUTP的情況下，延伸所述第一鏈cDNA以產(chǎn)生延伸反應(yīng)產(chǎn)物，所述延伸反應(yīng)產(chǎn)物包含與所述第二引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的序列；以及通過優(yōu)選不耐熱的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)的酶促反應(yīng)消化所述第二多核苷酸；

f)?在檢測(cè)部分存在的情況下，使用與所述第一引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的第一引物和與所述第二引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的第二引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增所述延伸反應(yīng)產(chǎn)物；以及

g)?通過實(shí)時(shí)熒光讀出而檢測(cè)所述擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述RNA分子具有15-200個(gè)核苷酸，優(yōu)選20-100個(gè)核苷酸的長度。

3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述RNA分子選自成熟miRNA(miRNA)、前體miRNA(pre-miRNA)、初級(jí)miRNA前體(pri-miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、piRNA(piwi-相互作用RNA)、前體piRNA和短發(fā)夾RNA(shRNA)。

4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟a)的所述RNA分子在3′-末端通過多核苷酸尾延伸，該延伸優(yōu)選通過聚腺苷酸聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶或連接酶的酶促反應(yīng)，更優(yōu)選通過聚腺苷酸聚合酶的酶促反應(yīng)來進(jìn)行。

5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第一多核苷酸與所述RNA分子的序列互補(bǔ)、與所述多核苷酸尾互補(bǔ)，或與二者均互補(bǔ)。

6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述第二多核苷酸具有3′-末端磷酸形式的封閉的3′-末端。

7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟f)中的所述檢測(cè)部分是嵌入染料。

8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的方法，其特征在于步驟f)中的所述檢測(cè)部分是水解探針。

9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于在步驟f)中擴(kuò)增至少兩種不同的延伸反應(yīng)產(chǎn)物。

10.權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述步驟f)中的擴(kuò)增在至少兩種水解探針存在的情況下進(jìn)行，其中至少一種所述水解探針對(duì)特定種類的RNA分子具有特異性，并且其中所述探針包含不同組的供體/受體部分。

11.權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述特定種類的RNA分子源自一種前體分子，優(yōu)選地所述特定種類的RNA分子具有不同長度。

12.權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)的方法，其特征在于不同種類的RNA分子之間的比例通過不同擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，優(yōu)選地通過具有可區(qū)分的熒光讀出的不同擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)來確定。

13.試劑盒，包含:

如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所定義的第一和第二多核苷酸，

一組dNTPs，

逆轉(zhuǎn)錄酶，以及

檢測(cè)部分，優(yōu)選對(duì)一種或多種不同RNA分子具有特異性的一種或多種水解探針，

具有尿嘧啶-DNA-糖基化酶?(UNG)?活性的酶，

以及任選地如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所定義的第一和/或第二引物。

14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒用于檢測(cè)RNA分子，優(yōu)選用于檢測(cè)如權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所定義的一種或多種RNA分子的用途。