[發明專利]一種細菌的檢測方法

無效

• 申請號: 201010593081.2
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102108375A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發明（設計）人: 王振新;高晶清;劉殿駿
• 申請（專利權）人: 中國科學院長春應用化學研究所
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 魏曉波;逯長明

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體的說是涉及一種細菌的檢測方法和一種用于細菌檢測的凝集素修飾的金納米粒子及一種用于細菌檢測的試劑盒。

背景技術

當今社會，病毒性感染疾病有愈演愈烈之勢，但細菌感染仍然是人類健康的一大威脅。例如結核病造成的死亡仍然位居世界第一位，并且有卷土重來的跡象；食品來源的沙門氏菌、李斯特氏菌和大腸桿菌等是造成腹瀉的重要因素；引起肺炎的幾種病原如肺炎克雷伯氏菌、肺炎雙球菌、肺炎衣原體、肺炎支原體等往往對抵抗力低下、年老或年幼人群構成極大威脅；金黃色葡萄球菌感染十分頑固，而且耐藥性十分普遍；腦炎球菌對抵抗力尚不十分完善的兒童威脅較大。隨著細菌耐藥性的不斷增強，生物恐怖主義隱現以及食品污染等影響日常生活，傳染病的威脅越來越受到人們的關注，因此發展有效的細菌檢測方法對公共衛生有重要意義。

細菌的檢測方法多種多樣，目前細菌分類鑒定的常規方法主要依賴于細菌培養、染色以及顯微觀察技術，但是細菌需要進行分離、培養以及一系列的生物化學檢測使得該方法非常耗時(Manual?of?Clinical?Microbiology，9th?ed.，Am.Soc.Microbiol.：Washington，D.C.，2007)。此外，還有核酸(DNA標記探針、PCR等)技術和抗體檢測(ELISA酶聯免疫檢測、免疫熒光等)技術等，但上述方法屬于一對一的檢測模式，即一種標記探針只能檢測一種細菌。因此，亟待發展高效的細菌識別檢測技術。

生物芯片是目前基因組學、蛋白質組學研究的重要工具。生物芯片以其高通量、敏感、準確的特點，越來越多地應用于細菌快速檢測以及細菌糖組學的動力學研究(Nat.Chem.Biol.，2006，2，153-157)。但目前，生物芯片主要以熒光為檢測手段，在檢測靈敏度、選擇性等方面尚存在一定的缺點，因而發展生物芯片的檢測新方法對其發展有重要意義(Nature，2007，4，437-444)。

發明內容

有鑒于此，本發明目的是針對現有的檢測方法靈敏度和選擇性欠佳的缺陷，提供一種靈敏度和識別度更高的細菌的檢測新方法。

為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

一種細菌的檢測方法，包括以下步驟：

步驟1：提供對照細菌樣品；

步驟2：固定有一種以上凝集素的固體支持物分別與待測樣品和對照細菌樣品充分作用，洗滌除去固體支持物上未結合的樣品；

步驟3：洗滌后的固體支持物與凝集素修飾的金納米粒子充分作用，洗滌除去固體支持物上未結合的金納米粒子；

步驟4：檢測固體支持物上結合的金納米粒子的共振光散射信號，與細菌標準品共振光散射信號比較，分析待測樣品細菌種類。

細菌表面覆蓋著多種不同糖綴合物，如糖蛋白、糖脂、糖胺聚糖和蛋白多糖等，而且不同細菌表面覆蓋糖基的種類不完全相同，如大腸桿菌表面覆蓋有唾液酸、巖藻糖、末端乙酰氨基半乳糖、α-半乳糖、末端乙酰葡萄糖和α-甘露糖等糖基，而與大腸桿菌不同，枯草芽孢桿菌表面除覆蓋有唾液酸、巖藻糖、末端乙酰氨基半乳糖、α-半乳糖、末端乙酰葡萄糖和α-甘露糖等糖基外，還存在葡萄糖-β-1，4葡萄糖低聚物。

凝集素(lectin)是從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，能識別單糖或寡糖中特定的糖基序列，并與之結合，常用于寡糖和糖復合物的分離純化和糖鏈的結構分析。目前發現的凝集素有100多種，常用的為植物凝集素(Phytoagglutin，PNA)，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A、麥胚素、花生凝集素和大豆凝集素等，凝集素是它們的總稱。一種凝集素可以識別一種或幾種特定的糖基序列，并與之結合。如蓖麻凝集素I可以識別半乳糖-β(1，4)葡萄糖(Galβ(1，4)GlcNAcβ1)糖基，大豆凝集素可以特異性識別末端乙酰氨基半乳糖(Terminal?GalNAc)糖基，麥胚凝集素可以特異性識別β-乙酰葡萄糖胺、唾液酸和乙酰氨基半乳糖糖基(β-GlcNAc，sialic?acid，GalNAc)。