[發明專利]快速檢測人腸道病毒71型的熒光定量PCR試劑盒

無效

• 申請號: 201010592659.2
• 申請日: 2010-12-17
• 公開（公告）號: CN102108422A
• 公開（公告）日: 2011-06-29
• 發明（設計）人: 王業富;唐景峰;汪曉莉;楊敬鏡;王維旭
• 申請（專利權）人: 武漢百泰基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

技術領域

本發明涉及一種引起人類多種疾病病原體基因檢測技術，尤其涉及一種快速檢測人腸道病毒71型熒光定量PCR試劑盒，適用于人腸道病毒71型的定性定量檢測。

背景技術

人腸道病毒71型(Enterovirus?71，EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)，同一屬的病毒還有脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒和埃可病毒等。這類病毒通過在人體的消化道組織中侵襲與繁殖后經過血液循環傳播，而最終導致多種臨床病征。EV71最初于1969年由Schmidt等從美國加利福尼亞州1名9個月大的腦炎患兒的腦脊液中分離出，1972年定出血清型，并于1974年首次報道。自報道以來，該病毒在世界范圍內引起十多次爆發與流行，因而受到了人們的廣泛關注。EV71感染多呈隱性，顯性表現輕微者可導致手足口病、腹瀉、皮疹、無菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎，嚴重者可表現為急性弛緩性癱瘓、全腦炎、肺水腫或出血等，最終可導致死亡。

因此，準確及時地診斷EV71對指導臨床治療、評估疾病的發展和預后具有重大意義。

近年來發展起來的熒光定量PCR(Fluorescence?Quantitative?PCR，FQ-PCR)技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(Eng?Lee?Tan，Li?Li?Gaynor?Yong，Rapid?detection?of?Enterovirus?71?by?real-time?TaqManRT-PCR[J].Journal?of?Clinical?Virology?42(2008)203-206；)和定量檢測(Singh?S，Chow?VTK，Phoon?MC，Chan?KP，Poh?CL(2002)Direct?detection?of?enterovirus?71(EV71)in?clinical?specimens?from?a?hand，foot?and?mouth?disease?outbreak?in?Singapore?by?reverse?transcription-PCR?with?universal?enterovirus?and?EV71-specific?primers.J?Clin?Microbiol?40：2823-2827；Tan?EL，Chow?VTK，Kumarasinghe?G，Lin?RTP，Mackay?IM，Sloots?TP，Poh?CL(2006)Specific?detection?of?Enterovirus?71?directly?from?clinical?specimens?using?real-time?RT-PCR?hybridization?probe?assay.Mol?Cell?Probes?20：135-140.)等方面得到廣泛應用，并且已經成為當前病毒核酸定量的主要方法，國內目前已有關于丙肝、乙肝、淋球菌、支原體、衣原體、艾滋病和結核定量檢測的試劑盒上市。

臨床檢測上傳統的培養法和血清學方法具有靈敏度低、特異性差、假陽性、耗時費力等缺點；常規PCR法雖然有簡便、快速、靈敏的優勢，但是有不能精確定量和PCR后處理產生污染導致的假陽性等問題；因此焏待開發一種精確、靈敏、快速和無污染的臨床檢驗方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種快速檢測人腸道病毒71型的熒光定量PCR試劑盒。

本發明采用以下技術方案：

一、PCR試劑盒

該試劑盒包括：RNA提取液(即TRIZOL核酸抽提試劑)、熒光定量PCR反應液、EV71標準陽性模板PMD18-T-EV71和陰性質控標準品；

1、熒光定量PCR反應液含有人腸道病毒71型特異性引物對和熒光探針，

1)人腸道病毒71型(EV71)：

正向引物為5′-GCCCAATYACAGCCTATYATAATAGC-3′，

反向引物為5′-TACARTCTGCCYACCCTARTCTC-3′，其中正向引物可向5’和3’端方向各延伸10個堿基，反向引物可向5’和3’端方向各延伸10個堿基；

2)熒光探針序列為5′-CTAGCGGCAGCCCAAA-3′，該熒光探針序列可向5’和3’端方向各延伸10個堿基，熒光探針5′端標記報告熒光基團FAM，3′端標記不發光的淬滅基團標記Eclipse，可以大大減少背景噪音的干擾。