[發明專利]一種簡易的卵母細胞體外成熟培養方法

無效

• 申請號: 201010590647.6
• 申請日: 2010-12-16
• 公開（公告）號: CN102154198A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 雷安民;趙貴民;吳蘇君;劉文強;井勇;楊文琳;高志敏
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于動物胚胎工程技術領域，涉及建立一種簡易的卵母細胞體外成熟培養方法。

背景技術

目前，卵母細胞體外成熟培養的氣相環境主要有兩種，含5％CO₂+95％的空氣(約20％O₂)，或5％CO₂+5％O₂+90％N₂。研究表明，輸卵管和子宮的氧分壓低于空氣，在高氧(20％O₂)下培養胚胎，可能會產生更多的氧自由基，影響胚胎發育。而當氧分壓從20％降低到5％～10％時，將會提高胚胎的發育潛能。所以，低氧環境更有利于卵母細胞的體外成熟和胚胎發育。明遠會對人體呼出氣體中N₂、O₂、CO₂體積分數進行了測定，結果是N₂％＝79.7％、O₂％＝15.12％、CO₂％＝5.1％。表明人體呼出的氣體中CO₂濃度正好接近5％，而且15％O₂濃度也提供了低氧環境，理論上可以用于卵母細胞的體外培養。

此外，西北農林科技大學干細胞工程技術研究中心雷安民導師等人近幾年在牛等家畜卵母細胞體外成熟上做了相關的研究。如：尿嘧啶和ATP對牛卵母細胞成熟及激活后孤雌胚胎發育的影響，牛體細胞核移植顯微操作環節的優化，牛生發泡期裸卵體外成熟培養體系的建立，牛去核卵母細胞能夠被孤雌激活并發育到桑椹胚等。

當前在家畜繁殖生物學研究領域，卵母細胞的體外培養技術已經被廣泛應用，并且可以在生產或者科研中作為一項基本技術用于支撐一些延伸項目的研究。但是卵母細胞體外成熟培養技術仍是一項實驗室技術，所需儀器設備對于普通生產單位或者一些基層的科研單位而言，仍然比較昂貴。這樣既不利于基層單位開展與之相關的研究與應用工作；而且當科研單位到基層開展技術推廣或者服務時，也不便于攜帶儀器設備。因此，建立一項操作簡單而又相對比較穩定的卵母細胞體外成熟培養技術是將其推廣到基層生產單位所必需的。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種卵母細胞體外成熟培養的方法。

本發明采用以下技術方案：

一種簡易的卵母細胞體外成熟培養方法，包括以下步驟：

A1卵母細胞的收集：從屠宰場收集性成熟牛卵巢，抽吸法采集卵丘卵母細胞復合體，挑選胞質均勻并有3層以上卵丘細胞緊密包圍的卵丘卵母細胞復合體用于體外成熟培養；

A2密閉氣袋的制備及卵母細胞的體外成熟培養：將培養有卵丘卵母細胞復合體的四孔板小心置入塑料袋，該塑料袋由避光耐熱無毒塑料制成，寬約15cm、長約20cm，一端開口，初步封口，封口處留通氣口，通過輸氣導管向袋內吹入人體呼出氣體，輸氣導管帶有0.22μm的微孔濾膜濾器，吹滿后排出，如此反復進行3～4次，確保氣袋內的空氣完全被人體呼出的混合氣體替代，然后將氣袋完全封閉，置于38.5℃生化培養箱中培養22～24h，挑選排出第一極體的成熟卵，繼續培養；

A3卵母細胞的孤雌激活及體外培養：在體外成熟培養第28h，化學方法激活，然后在卵裂培養液中培養3d，囊胚培養液中培養4d，7～9d后觀察統計囊胚率。所述的孤雌激活、卵裂培養、囊胚培養均在上述密閉氣袋、38.5℃生化培養箱中進行；

應用自制的密閉氣袋系統，只需普通的生化培養箱或水浴鍋就能完成卵母細胞和胚胎的體外培養，減少了對于貴重儀器的依賴，降低了研究門檻。應用該簡易密閉氣袋進行體外卵母細胞培養，能夠發育到囊胚，并且體外成熟率、卵裂率和囊胚率與正常CO₂培養箱中培養相比略有提高。密閉氣袋培養體系不但滿足了培養過程中對于CO₂濃度的要求，更提供了低氧環境，此外，人體呼出的混合氣體的濕度滿足了培養環境中飽和濕度的要求。

附圖說明

圖1密閉氣袋培養的牛卵母細胞及孤雌胚不同發育階段；

標尺：A、H為100μm，B、C、D、E、F、G為10μm)；

A、a：M?II期；

B、b：2-細胞期；

C、c：4-細胞期；

D、d：6-細胞期；

E、e：8-細胞期；

F、f：16-細胞期；

G、g：囊胚期；

H、h：孵化胚期；

A、B、C、D、E、F、G：光學顯微鏡；

a、b、c、d、e、f、g、h：熒光顯微鏡(核藍色)。

具體實施方式