[發(fā)明專利]尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010589838.0
• 申請(qǐng)日: 2010-12-09
• 公開（公告）號(hào): CN102168105A
• 公開（公告）日: 2011-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾富華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湛江師范學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00
• 代理公司: 湛江市三強(qiáng)專利事務(wù)所 44203
• 代理人: 龐愛英

1.一種尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：采用尾葉桉無性系種子萌發(fā)實(shí)生苗的下胚軸為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化與再生；愈傷組織誘導(dǎo)后與攜帶外源基因的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、芽增殖培養(yǎng)、不定芽伸長培養(yǎng)、選擇性生根培養(yǎng)及移栽，得到擬轉(zhuǎn)化植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：選取成熟的尾葉桉種子，經(jīng)50～55℃溫水浸泡后自然冷卻，經(jīng)70％乙醇滅菌1分鐘，無菌水沖洗2次，加入體積比為15％NaClO溶液，相對(duì)氯為3.75％，采用二次消毒法，消毒時(shí)間為9+9分鐘，無菌水沖洗5～6次，播種到不加激素的1/2MS培養(yǎng)基上，25±2℃暗培養(yǎng)7天后，在光照12小時(shí)/天、光照強(qiáng)度2000～2500lx條件下培養(yǎng)5～7天，得到實(shí)生苗；

所述1/2MS培養(yǎng)基是大量元素為MS的一半，其它不變；添加0.7％瓊脂、3％蔗糖，pH為5.8～6.0。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化利用下胚軸為外植體，下胚軸是指實(shí)生無菌苗苗齡為12～14天的下胚軸。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生方法，其特征在于：所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌菌液濃度OD₆₀₀為0.4～0.6，MS液體培養(yǎng)基重懸菌落，再將重懸的菌液用MS液體培養(yǎng)基稀釋20倍，浸染液pH為5.6。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生方法，其特征在于：所述共培養(yǎng)是指尾葉桉無菌苗下胚軸經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基暗培養(yǎng)6天，培養(yǎng)溫度為25±2℃；

所述共培養(yǎng)基為MS+LC?2mg/L+IAA?0.05mg/L+Vc?100mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH?5.8～5.9。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：所述不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)是指經(jīng)共培養(yǎng)基上培養(yǎng)的下胚軸轉(zhuǎn)入選擇性不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在25±2℃、光照強(qiáng)度2000～2500lx條件下培養(yǎng)2～3周，在兩端切口外周膨大成啞呤狀的愈傷處長出再生芽點(diǎn)；

所述選擇性不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為SDM+6-BA?1mg/L+NAA?0.05mg/L+腐胺500μmol/L+亞精胺50μmol/L+Vc?100mg/L+Kan?45mg/L+Cef?200mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH?5.8～5.9。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：所述芽增殖培養(yǎng)是指經(jīng)選擇性不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的下胚軸轉(zhuǎn)入芽增殖培養(yǎng)基上，在25±2℃、光照強(qiáng)度2000～2500lx條件下培養(yǎng)2～3周；

所述芽增殖培養(yǎng)基為SDM+6-BA?0.5mg/L+NAA?0.05mg/L+Kan?45mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH?5.8～5.9。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：所述不定芽伸長培養(yǎng)是指經(jīng)芽增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)的下胚軸轉(zhuǎn)入不定芽伸長培養(yǎng)基上，在25±2℃、光照強(qiáng)度2000～2500lx條件下培養(yǎng)，促進(jìn)芽伸長；

所述不定芽伸長培養(yǎng)基為1/2MS+NAA?0.05mg/L+LC?0.8mg/L+Vc100mg/L+Kan?45mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH?5.8～5.9。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：再生芽在不定芽伸長培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，芽可以繼續(xù)生長伸長，待芽伸長至約3～4cm并有3～4個(gè)節(jié)時(shí)，伸長芽最適宜生根。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：所述選擇性生根培養(yǎng)是指不定芽伸長后轉(zhuǎn)入選擇性生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以促其生根；

所述選擇性生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA?0.5mg/L+Kan?75mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH?5.8～5.9。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述尾葉桉遺傳轉(zhuǎn)化與再生的方法，其特征在于：所述移栽是指將生根良好的生根苗從恒溫光照培養(yǎng)箱移至室外自然環(huán)境中煉苗10～15天，用滅菌的黃心土與腐殖質(zhì)土，比例為2∶1，進(jìn)行移栽，得到完整的尾葉桉植株。