[發明專利]μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制備方法

有效

• 申請號: 201010588812.4
• 申請日: 2010-12-15
• 公開（公告）號: CN102154257A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 李暉;董欽;李鳳蘭;管薈苓;李金波;馬健慧;趙雪嬌;蔣倩倩
• 申請（專利權）人: 哈爾濱醫科大學
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/70
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;余光軍

技術領域

本發明涉及μ-芋螺毒素-KIIIA的制備方法，尤其涉及μ-芋螺毒素-KIIIA的基因工程制備方法，屬于μ-芋螺毒素-KIIIA的制備領域。

背景技術

近年來，隨著分子生物學與電生理，尤其是膜片鉗技術的發展，人們認識到Na⁺通道的結構和功能變化是慢性疼痛的病理生理機制，應用特異性的Na⁺通道亞型阻止藥治療慢性頑固性疼痛可取得良好的效果。

μ-芋螺毒素是高度特異的Na⁺通道阻滯劑，可以區分Na⁺通道的不同亞型(Shon?K，Olivera?BM，Watkins?M，et?al.μ-Conotoxin?PIIIA，a?new?peptide?for?discriminating?among?tetrodotoxin-sensitive?Na?channel?subtypes.)，因其序列短，活性高，選擇性強，已證實具有顯著的鎮痛效果(Fusetani?N.Drugs?from?the?sea.Karger：Basel?Freiburg?Paris?London?New?York.2000；1-5.)，對于發展鈉通道探針及鎮痛藥物具有重要意義。

高選擇性的TTX-R鈉通道抑制劑對神經性疼痛或炎癥痛非常有效，且副作用低。作用于TTX-R?VSSCs的芋螺毒素μ-SmIIIA、SIIIA和KIIIA等，已發現具有顯著的鎮痛作用(Haefner?B.Drugs?from?the?deep：marine?natural?products?as?drug?candidates.Drug?Discov?Today.2003；8(12)：536-544.)，目前芋螺毒素的獲得主要是直接提取或人工化學合成(權婭茹，羅素蘭，林秋金，長孫東亭，張本.芋螺毒素RNA的提取及其cDNA合成的研究.中國海洋藥物雜志.2005；24(2)：1-5.)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用基因工程獲得μ-芋螺毒素--KIIIA的方法。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

一種μ-芋螺毒素--KIIIA的基因工程制備方法，包括：將μ-芋螺毒素KIIIA基因插入帶有Trx-tag的原核表達載體構建得到重組原核表達載體；將所述的重組原核表達載體轉化大腸桿菌，IPTG誘導目的蛋白的表達；收集并純化所表達的蛋白，即得。

其中，所述的μ-芋螺毒素-KIIIA基因是通過合成單鏈DNA序列，形成雙鏈目的DNA序列而獲得的；

所述的帶有Trx-tag的原核表達載體優選為pET-32a(+)；硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一組小分子蛋白質，分子量約為12Kd，廣泛存在于真核生物和原核生物中，它們都包含二硫鍵活性位點序列-Cys-Gly-Pro-Cys-，是巰基-二硫鍵氧化還原酶。其主要作用是可以增加重組蛋白的可溶性，使蛋白質在大腸桿菌中可溶性表達，有利于蛋白純化和活性的研究。大腸桿菌表達系統是目前基因工程中比較成熟、經典的表達方法。而PET表達體系則為該系統中的經典，本發明采用了pET載體作為蛋白表達載體，該載體的特點是帶有Trx-tag，會產生Trx和目的蛋白的融合蛋白。

所述的重組表達載體的構建包括以下內容：pET-32a(+)載體的酶切；酶切產物的膠回收及純化；目的序列和載體的連接；連接產物的鑒定。連接產物的鑒定包括：制備感受態細胞、轉化反應、重組質粒提取和鑒定。

針對于μ-芋螺毒素二硫鍵較多結構較復雜的特點，本發明優選大腸桿菌Origami2(DE3)為大腸桿菌宿主菌。Orgami2(DE3)為K-12衍生的宿主菌，具有硫氧還蛋白還原酶突變型(trxB)和谷胱甘肽還原酶(gor)突變型基因，具有增加胞漿內二硫鍵的形成的特性。Orgami2(DE3)表達的活性蛋白量比其它大腸桿菌宿主菌高10倍以上，是表達富含二硫鍵蛋白的理想宿主。即使和其他大腸桿菌宿主菌的總體表達水平相似，Orgami2(DE3)表達的活性蛋白比其它宿主菌高10倍以上。Orgami宿主菌與氨芐抗性質粒相容，可用于pET-32載體，硫氧還蛋白標簽能夠進一步增強在胞漿內形成二硫鍵。

本發明對IPTG誘導目的蛋白的表達條件進行了優化和篩選，結果發現，初始菌濃度(OD₆₀₀)以及誘導時間對于蛋白表達量有著較為顯著的影響，進一步的實驗發現，當OD₆₀₀＝1.0左右時，蛋白表達量最高。當誘導時間為20h，蛋白的表達量增加率最高。