[發明專利]藍耳病RT-LAMP檢測方法及檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201010583031.6
• 申請日: 2010-12-10
• 公開（公告）號: CN102277445A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 楊素;廖秀云;廖明;沙才華;徐海聶
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 王賢義

技術領域

本發明涉及一種藍耳病RT-LAMP檢測方法及檢測試劑盒。

背景技術

豬藍耳病主要是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?Reproductive?and?Respiratory?Syndrome?virus，PRRSV)感染引起的疾病，1990～1991年藍耳病在歐洲爆發，引起超過100萬頭豬死亡，1991年荷蘭人Wenswort等首次從病豬體內分離出該病毒。藍耳病豬死亡率一般為50%，甚至90%～95%，主要引起妊娠母豬流產、早產、死產和木乃伊胎，而仔豬主要有咳嗽、呼吸困難等癥狀。藍耳病是OIE規定的B類動物傳染病，集約化養殖場一旦感染，難以凈化，自美國1987年首次報道以來,?藍耳病已蔓延到全球，每年都造成巨大的經濟損失，對世界各國的養豬業構成了嚴重的威脅，快速、特異、敏感的檢測PRRSV對養豬業有效控制PRRSV具著重要的意義。

國內外學者已經建立了多種檢測藍耳病的方法。間接免疫熒光試驗、免疫過氧化物酶單層試驗等免疫學檢測方法，檢疫周期長、操作繁瑣、確診困難，因而不利于準確、快速、高效的監控PRRSV的疫情。隨著現代分子生物學的發展，已有多種分子診斷技術應用于藍耳病的檢測，如RT?-?PCR、基因芯片技術、核酸序列依賴性擴增（NASBA?）、實時熒光RT-PCR、錯配擴增突變試驗（MAMA）等，但這些方法均需要昂貴的專用儀器和試劑，不適合在基層實驗室推廣應用，而新型核酸擴增技術——環介導等溫擴增（LAMP）與其它檢測方法相比，具有簡便、快速、特異等優勢，不需PCR儀，在水浴鍋中即可完成擴增，特別適合于基層實驗室推廣使用。目前來說還沒有建立了一種方便在野外及基層實驗室進行藍耳病檢測的簡便、快速、特異的RT-PCR檢測方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種簡便、快速、特異的藍耳病RT-PCR檢測方法及檢測試劑盒。

本發明所采用的技術方案是：本發明涉及的藍耳病RT-LAMP檢測方法，包括以下步驟：

A：取待檢樣品提取核酸，進行反轉錄以得到cDNA；

B：以所述cDNA為模板，用外引物（B3、F3）和內引物（FIP、BIP）在反應體系中進行恒溫擴增；所述外引物（B3、F3）和內引物（FIP、BIP）的序列分別如下：

B3：5’-ATGCTGAGGGTGATGCTGT-3’

F3：5’-CATTTCCCTCTAGCGACTGA-3’

FIP：5’-GCCCTGATTGAAGGCAGTCTGGACTTTACCCCTAGTGAGCGG-3’

BIP：5’-ACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATCAGACGCACAGTATGTTGC-3’；

C：在擴增產物中加入顯色劑根據顏色變化來判定結果；或者取擴增產物用瓊脂糖電泳檢測方法來判定結果。

經過優化設計，所述反應體系中的外引物（B3、F3）的濃度均為10μM，內引物（FIP、BIP）的濃度均為80μM。

經過優化設計，在步驟B中恒溫擴增的反應條件為：63℃?1h，82℃終止反應。

在步驟C結果判定步驟中加入的顯色劑為SYBR?Green?I，判定方法為：反應結束后，分別在各反應管中加入2μL～3μL?SYBR?Green?I，混勻后觀察顏色變化，當陽性對照管顯示淡綠色，陰性對照管顯示淡橘紅色時，顯示淡綠色的管判為陽性，顯示淡橘紅色的管判為陰性。

本發明所涉及的檢測試劑盒中RT-LAMP反應體系為：10×ThermoPol?Buffer?2.5μl，Bst?DNA聚合酶?1.0μl，10μM的外引物B3?1μl，10μM的外引物F3?1μl，80μM的內引物BIP?1μl，80μM?的內引物FIP?1μl，15ng/μl的cDNA?1μl，5M的Betaine?5μl，DEPC水補至25μL；其中該反應體系中還含有Mg²⁺?3～15mM，dNTP?0.2～1.2mM。

所述反應體系中Mg²⁺和dNTP的具體優選濃度分別為7.5mM、0.4mM。