[發明專利]藍耳病RT-LAMP檢測方法及檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201010583031.6
• 申請日: 2010-12-10
• 公開（公告）號: CN102277445A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 楊素;廖秀云;廖明;沙才華;徐海聶
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 王賢義

1.一種藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

A：取待檢樣品提取核酸，進行反轉錄以得到cDNA；

B：以所述cDNA為模板，用外引物（B3、F3）和內引物（FIP、BIP）在反應體系中進行恒溫擴增；所述外引物（B3、F3）和內引物（FIP、BIP）的序列分別如下：

B3：5’-ATGCTGAGGGTGATGCTGT-3’

F3：5’-CATTTCCCTCTAGCGACTGA-3’

FIP：5’-GCCCTGATTGAAGGCAGTCTGGACTTTACCCCTAGTGAGCGG-3’

BIP：5’-ACCCTGTCAGATTCAGGGAGGATCAGACGCACAGTATGTTGC-3’；

C：在擴增產物中加入顯色劑根據顏色變化來判定結果；或者取擴增產物用瓊脂糖電泳檢測方法來判定結果。

2.根據權利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，所述反應體系中的外引物（B3、F3）的濃度均為10μM，內引物（FIP、BIP）的濃度均為80μM。

3.根據權利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，在步驟B中恒溫擴增的反應條件為：63℃?1h，82℃終止反應。

4.根據權利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法，其特征在于，在步驟C結果判定步驟中加入的顯色劑為SYBR?Green?I，判定方法為：反應結束后，分別在各反應管中加入2μL～3μL?SYBR?Green?I，混勻后觀察顏色變化，當陽性對照管顯示淡綠色，陰性對照管顯示淡橘紅色時，顯示淡綠色的管判為陽性，顯示淡橘紅色的管判為陰性。

5.一種用于權利要求1所述的藍耳病RT-LAMP檢測方法的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒中RT-LAMP反應體系為：10×ThermoPol?Buffer?2.5μl，Bst?DNA聚合酶?1.0μl，10μM的外引物B3?1μl，10μM的外引物F3?1μl，80μM的內引物BIP?1μl，80μM?的內引物FIP?1μl，15ng/μl的cDNA?1μl，5M?的Betaine?5μl，DEPC水補至25μL；其中該反應體系中還含有Mg²⁺?3～15mM，dNTP?0.2～1.2mM。

6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述反應體系中Mg²⁺和dNTP的濃度分別為7.5mM、0.4mM。