[發明專利]小鼠成纖維細胞Ⅲ型膠原的熒光定量PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201010581404.6
• 申請日: 2010-12-09
• 公開（公告）號: CN102559849A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 余欣
• 申請（專利權）人: 余欣
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 郭國中

技術領域

本發明設計一種檢驗技術領域的檢測方法，具體是一種小鼠成纖維細胞III型膠原的熒光定量PCR檢測方法。

背景技術

成纖維細胞是動物體內結締組織的主體細胞成分，其分泌的膠原纖維，彈性纖維及基質成分，與成纖維細胞一同構成了一些器官的主體結構，為器官中功能細胞提供生存的場所。一方面，正常皮膚以I型和III型膠原為主，在皮膚老化過程中，成纖維細胞數量逐漸減少，合成膠原蛋白和彈性蛋白能力下降，膠原含量逐漸降低。另一方面，在一些功能性器官如肝臟，在受到各種慢性損傷的愈合反應中，肝臟內成纖維細胞異常活躍，合成并分泌大量外基質，主要是I型和III膠原，降解則絕對或相對不足，從而使細胞外基質在肝臟內彌漫性沉積、形成肝纖維化。

經過對現有技術的大量文獻檢索后發現，目前檢測III型膠原的方法主要是檢測蛋白含量，另一個是利用逆轉錄聚合酶連是反應(RT-PCR)。但是這些方法耗時長，無法定量，結果無法反應基因表達改變的真實情況，從而無法為抗衰老物質的研究和抗纖維化新藥研發提供準確的科學數據。熒光定量RT-PCR克服了傳統PCR費時，無法定量與擴增后需要電泳檢測等缺點，實現了對樣品中單個細胞內III型前膠原基因含量的定量檢測，具有簡單易操作，結果直觀，敏感性高，特異性強，重復性好等優點，已成為研究基因表達的重要方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種小鼠成纖維細胞III型膠原的熒光定量PCR檢測方法。本發明的方法具有靈敏性高，穩定性高，可以定量，特異型好，假陽性低等特點。

本發明是通過以下的技術方案實現的，本發明的方法包括如下步驟：

步驟一，以小鼠III型前膠原基因中的內含子序列SEQ?ID?NO：1為靶目標，設計引物；

步驟二，利用堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示的基因片段構建重組質粒；

步驟三，提取樣品的RNA，逆轉錄得到cDNA；

步驟四，按照常規熒光定量PCR檢測方法檢測樣品中的III型前膠原基因表達的含量。

優選地，步驟一中，所述引物為：上游引物：5’-CAGAGGCTTTGATGGACGCA-3’，下游引物：5’-TCTCCCTTCGCACCGTTCTT-3’。

優選地，步驟二中，所述重組載體使用的質粒是pET-32a。

優選地，步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，PCR單個循環為：95℃預變性2分鐘；95℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸40秒。

優選地，步驟四中，所述熒光定量PCR檢測方法中，共32個PCR單個循環。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：與傳統RT-PCR相比，本發明的方法具有靈敏性高，穩定性高，可以定量，特異型好，假陽性低等特點；本發明的方法可以同時進行大量樣品的檢測，具有高通量性；本發明的方法既可以檢測體外培養組織或細胞的樣品，也可以檢測活體組織樣品；與常規PCR相比，本發明的方法無需擴增后電泳分析，避免了PCR產物污染的風險，也避免了對操作人員接觸有毒化學品的風險；本熒光定量PCR檢測方法具有檢測范圍廣的特點，在100～109拷貝范圍內具有良好的線性關系，檢測范圍可以達到10個數量級。

附圖說明

圖1為實施例中III型前膠原基因絕對定量的標準曲線示意圖；

圖2為實施例中熒光定量PCR敏感性檢測的熒光信號圖；

圖3為實施例中熒光定量PCR引物特異性檢測的熒光信號圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件，例如薩姆布魯克等分子克隆：實驗手冊第三版(科學出版社，2002)中所述的條件，或者按照各制造商所建議的條件。

實施例

1、設計引物

從基因數據庫中檢索獲得小鼠III型前膠原的mRNA序列(Gene?Bank登錄號為NM_009930.2)，通過DNAstar軟件進行序列比對，得到小鼠III型前膠原的特異性保守序列SEQ?ID?NO：1；

通過Primer5.0軟件對該保守序列進行引物設計，得到一對特異性引物，目的擴增片段為531bp。

上游引物：5’-CAGAGGCTTTGATGGACGCA-3’；(SEQ?ID?NO：2)