[發明專利]檢測糞便中microRNA表達水平的方法和內參基因的選擇方法

無效

• 申請號: 201010579422.0
• 申請日: 2010-12-08
• 公開（公告）號: CN102071253A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 李兆申;任艷;高軍;王小瑋;劉建強;顧駿俊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海大邦律師事務所 31252
• 代理人: 周東萍

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種檢測糞便中microRNA表達水平的方法和內參基因的選擇方法。

背景技術

microRNA(miRNA)分子是近幾年來分子生物學和遺傳學領域的研究熱點。miRNA是一類新發現的非編碼小RNA分子，通常在轉錄后水平調控基因表達。miRNA基因先轉錄產生幾百至幾千個核苷酸的初級產物(pri-miRNA)，在核內被RNaseIII內切酶家族的Drosha酶切割成70個核苷酸左右的發夾狀前體(pre-miRNA)，pre-miRNA在轉運蛋Exortin＝5的作用下轉運出核，然后經Dicer酶切割成約22nt的成熟miRNA(Gregory?RI，Shlekhattar?R.MicroRNA?biogenesisand?cancer.Cancer?Res，2005，65(9)：3509-3512.)。成熟的miRNA通過形成RNA誘導沉默復合物(RNA-induced?silencing?complex，RISC)，與靶mRNA完全或不完全匹配結合，誘導靶mRNA降解或阻遏其轉錄后翻譯，從而調節細胞增殖、分化與凋亡，參與個體發育、機體代謝以及腫瘤發生、發展等過程。

以往的研究發現蛋白編碼基因的異常會導致腫瘤的發生發展，自2002年11月Croce研究組首次報道miRNA異常與腫瘤相關，越來越多的證據顯示miRNA在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。有一些實驗和臨床分析指出miRNAs可能是作為癌基因或抑癌基因的一個新的分類而發揮作用。那些在腫瘤中表達升高的可認為是癌基因，這些癌基因miRNAs，通常通過負向調節腫瘤抑制基因或控制細胞分化或凋亡的基因而促進腫瘤的發展。已發現有許多miRNAs在不同腫瘤中明顯過表達。

目前檢測microRNA表達水平的方法主要包括microarray、RT-PCR/Northern?blot、Ribonulease?protection?assay(RPA)、Bead-based?flow?cytometric?assay(磁珠流式檢測)、原位雜交等。由于miRNA序列很短，增加了檢測難度。本研究所用的Step-loop實時定量RT-PCR是一項高特異度、敏感度的檢測miRNA表達的實驗技術，包括設計具有莖環(stem-loop)結構的反轉錄引物和用miRNA熒光標記的特異分子探針進行實時PCR?2個關鍵步驟。Shi(Shi?R，ChiangVL.Facile?means?for?quantifying?microRNA?expression?by?real?time?PCR[J].Biotechniques，2005，39(4)：519-525等把RNA加尾和引物延伸用于實時定量RT-PCR，成功檢測了植物中miRNA表達。張旗(張旗，何湘君，潘秀英.RNA加尾和引物延伸RT-PCR法實時定量檢測microRNA[J].北京大學學報，2007，39(1)：87-91)等用同樣的方法對15種miRNA在大鼠心、肝和大腦皮層的表達進行檢測，驗證了該技術的可靠性。

目前糞便中基因檢測由于其廣泛應用前景，已引起人們重視，，但其所用檢測方法不同，相互間可比性較差。因此需要一方面尋找新的分子標志物，另一方面改進檢測方法和技術，提高檢測敏感性，可為無創性胰腺癌篩查和診斷提供新的選擇。

基于上述研究表明，有關microRNA的研究大多局限于血液病，肺癌、肝細胞癌、乳腺癌、結直腸癌，對胰腺癌的研究甚少，在胰腺癌的研究中也僅僅限于組織、血液等樣本，并未曾報道在糞便中的microRNA檢測。放之四海而皆準的看家基因其實是不存在的，找出合適的看家基因作為內參對于基因表達分析的準確定量至關重要，目前大多通過使用geNorm程序，從一系列不同功能的候選看家基因中選擇出最適數目的看家基因用于目標基因的標準化，從而可以達到準確定量的實驗目的.

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種檢測糞便中microRNA表達水平的方法，該方法通過選擇合適內參的內參基因，制定一種計算方法呈現不同microRNA在糞便中的差異表達。

為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：

一種檢測糞便中microRNA表達水平的方法，主要包括以下步驟：

(1)將收集的糞便標本用糞便抽提試劑盒進行提取，提取后用NanoDrop鑒定RNA的濃度；

(2)將鑒定好的RNA進行逆轉錄生成cDNA，通過Real-time?RT-PCR檢測目的microRNA的表達；