[發明專利]檢測糞便中microRNA表達水平的方法和內參基因的選擇方法

無效

• 申請號: 201010579422.0
• 申請日: 2010-12-08
• 公開（公告）號: CN102071253A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 李兆申;任艷;高軍;王小瑋;劉建強;顧駿俊
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海大邦律師事務所 31252
• 代理人: 周東萍

1.一種檢測糞便中microRNA表達水平的方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

(1)將收集的糞便標本用糞便抽提試劑盒進行提取，提取后用NanoDrop鑒定RNA的濃度；

(2)將鑒定好的RNA進行逆轉錄生成cDNA，通過Real-time?RT-PCR檢測目的microRNA的表達；

(3)得到各個microRNA的CT值，再通過-ΔΔCt方法計算各microRNA的表達豐度，計算公式為-ΔΔCt＝-{(Sample?Cttarget-Sample?CtmiR-16)-(Control?Cttarget-ControlCtmiR-16)}；

(4)選取合適的內參基因，挑選出目的差異基因。

2.根據權利要求1所述的檢測糞便中microRNA表達水平的方法，其特征在于，所述糞便抽提試劑盒抽提取總microRNAs。

3.根據權利要求1所述的檢測糞便中microRNA表達水平的方法，其特征在于，用Genorm軟件選擇合適的內參基因。

4.一種用于檢測胰腺癌的內參基因的選擇方法，其特征在于，主要包括以下步驟：

(1)將收集的胰腺癌患者的糞便標本用糞便抽提試劑盒進行提取，提取后用NanoDrop鑒定RNA的濃度；

(2)將鑒定好的RNA進行逆轉錄生成cDNA，通過Real-time?RT-PCR檢測目的microRNA的表達；

(3)得到各個microRNA的CT值，再通過-ΔΔCt方法計算各microRNA的表達豐度，計算公式為-ΔΔCt＝-(Ct_{target?microRNAs}-Ct_miR-16)；

(4)選取合適的內參基因。

5.根據權利要求4所述的用于檢測胰腺癌的內參基因的選擇方法，其特征在于，步驟(1)為：標本收集于凍存管后即時置于冰盒中，在6小時內轉移至-80℃的超低溫冰箱保存；糞便的RNA抽提時需從凍存管中稱取糞便，用糞便抽提試劑盒提取到總microRNAs，提取后用NanoDrop鑒定RNA的濃度。

6.根據權利要求4所述的用于檢測胰腺癌的內參基因的選擇方法，其特征在于，用Genorm軟件選擇合適的內參基因：在Excel中設定不同樣本中某一看家基因Ct值最小者的表達量為1，其他樣本與上述看家基因的相對表達量則為2^-ΔCt，其中，ΔCt＝各樣本Ct值-最小Ct值；將得到的相對表達量數據導入Genorm程序；利用該程序計算基因表達穩定度的平均值，對看家基因的表達穩定度進行排序，值越小，表達越穩定，并通過看家基因標準化因子的配對差異分析來判定看家基因的最適數目。

7.根據權利要求4-6任一項所述的用于檢測胰腺癌的內參基因的選擇方法，其特征在于，所述內參基因為miR-16。