[發(fā)明專利]嗎啡-氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010578686.4
• 申請(qǐng)日: 2010-12-08
• 公開（公告）號(hào): CN102128930A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/64
• 分類號(hào): G01N33/64;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/532
• 代理公司: 沈陽(yáng)東大專利代理有限公司 21109
• 代理人: 戚羽

1.一種嗎啡-氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡，其特征是：本發(fā)明由一個(gè)封閉的塑料外殼包裝而成,該外殼的上層開有顯色孔和加樣孔,在外殼內(nèi)腔裝有磁白板，磁白板上覆有膜結(jié)構(gòu)，膜結(jié)構(gòu)由下至上依次疊放樣品墊，吸水紙,?玻璃纖維素膜和硝酸纖維素膜；其中玻璃纖維素膜上包被有膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體和膠體金標(biāo)記鼠抗嗎啡單克隆抗體；硝酸纖維素膜上含有嗎啡、氯胺酮抗原和一種羊抗鼠多克隆抗體；與顯色孔對(duì)應(yīng)的硝酸纖維素膜上用點(diǎn)膜機(jī)分別劃定兩條檢測(cè)線和一條質(zhì)控線，其中一條檢測(cè)線為氯胺酮完全抗原，另一條檢測(cè)線為嗎啡完全抗原；質(zhì)控線為純化后的羊抗鼠IgG?多抗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種嗎啡-氯胺酮膠體金法毒品檢測(cè)試卡，其特征是：所述的玻璃纖維素膜上包被的膠體金標(biāo)記鼠抗氯胺酮單克隆抗體由如下方法制成：（1）、氯胺酮結(jié)合抗原制備：用重氮化法將半抗原氯胺酮偶聯(lián)于載體蛋白BSA,形成偶聯(lián)抗原；制備過程如下,?取5毫克氯胺酮溶于0.1摩爾/升?HCl?,并預(yù)冷至0～5℃,加入10毫克NaNO₂,4℃攪拌6小時(shí)；然后加入20毫克BSA(預(yù)先溶于0.1摩爾/升?磷酸鹽緩沖液,pH8.6),4℃繼續(xù)攪拌6小時(shí)；用葡聚糖凝膠SephadexG-25凝膠過濾純化偶聯(lián)物,純化后凍干存于4℃?zhèn)溆茫唬?）、小鼠免疫：以BSA偶聯(lián)氯胺酮免疫8?周齡BALB/C小鼠15?只,免疫劑量50微克/只,皮下分點(diǎn)注射；共免疫3?次,每次免疫間隔3周；最后1次免疫10天后,斷尾采血分離血清,用間接ELISA?法檢測(cè)血清抗體效價(jià)；若效價(jià)>10^-4即可用于細(xì)胞融合；（3）、脾細(xì)胞的制備：末次免疫后3天摘眼球取血分離血清，并同時(shí)處死，浸泡碘酒5分鐘，無菌解剖取脾，用RPMI1640培養(yǎng)液洗二次后，研磨通過100目不銹鋼網(wǎng)，獲得游離細(xì)胞，再用氯化銨法溶解祛除紅細(xì)胞，然后計(jì)數(shù)脾細(xì)胞并用10％FBS-RPMI?1640培養(yǎng)液配制成2X10⁸個(gè)/毫升濃度用于細(xì)胞融合；（4）、SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)與細(xì)胞融合：復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞，于10％FBS-RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后配成4?X10⁷個(gè)/ml細(xì)胞濃度；分別取配制的上述濃度的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞各1毫升混合，使其比例為5：1；然后加入50%PEG?1毫升，于37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞融合；（5）、融合細(xì)胞的培養(yǎng)及陽(yáng)性雜交瘤的篩選與克隆：融合后的細(xì)胞置37℃,5%CO₂培養(yǎng)箱中以HAT、HT?培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)；用間接ELISA法以BSA偶聯(lián)氯胺酮微克/毫升包被酶標(biāo)板進(jìn)行陽(yáng)性篩選；對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化；（6）、抗氯胺酮單克隆抗體的測(cè)定與制備：給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株10⁷個(gè)細(xì)胞,7天后抽取腹水,以硫酸鈉鹽析法提純抗體,測(cè)其ELISA效價(jià)；以檢測(cè)樣品于492納米波長(zhǎng)測(cè)得吸光值與陰性對(duì)照的比值≥2.1定為陽(yáng)性，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)為抗氯胺酮單克隆抗體的效價(jià)；測(cè)定后結(jié)果作為使用時(shí)稀釋倍數(shù)的依據(jù)；（7）、膠體金制備：將容積為1升三角燒瓶置于加熱磁力攪拌器上,加入500毫升蒸餾水,加熱攪拌至90℃時(shí)，加入0.5毫升10%氯金酸溶液；將此溶液煮沸5分鐘,加入1.00毫升12%檸檬酸三鈉溶液,保持此溶液沸騰10分鐘,把此溶液從加熱磁力攪拌器上取下；待溫度將至25℃時(shí)，裝到潔凈容器內(nèi),4℃避光保存；（8）、膠體金-氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物的制備：已制備好的膠體金100毫升,用0.1摩爾/升碳酸鉀將溶液調(diào)至pH9.0;在磁力快速攪拌下迅速加入抗氯胺酮單克隆抗體5毫克,?攪拌10分鐘后加入10%?牛血清白蛋白1毫升，繼續(xù)攪拌10分鐘;?高速冷凍離心機(jī)于4℃，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30?分鐘；棄上清,?沉淀即為膠體金-氯胺酮單克隆抗體結(jié)合物；用0.01摩爾/升、pH8.2?PBS緩沖液稀釋至一定濃度后,均勻浸在玻璃纖維膜上,37℃?干燥備用。