[發(fā)明專利]用于鑒定短小乳桿菌的引物序列及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010574429.3
• 申請(qǐng)日: 2010-12-06
• 公開（公告）號(hào): CN102094089A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張軍;田子罡;閆秩潔;王安如;張廣民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及用于鑒定短小乳桿菌的引物序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

短小乳桿菌(Lactobacillus?brevis)是乳桿菌屬的重要菌種之一，其來源廣泛，在泡菜、鮮奶、動(dòng)物腸道中均有發(fā)現(xiàn)。短小乳桿菌具有產(chǎn)γ氨基丁酸、共軛亞油酸、蘋果酸、干擾素等多種功能產(chǎn)物的特性，在食品和醫(yī)藥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)分離鑒定短小乳桿菌多采用的平皿培養(yǎng)法、生化試驗(yàn)、氣體生長(zhǎng)試驗(yàn)等傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法，上述方法存在檢出周期長(zhǎng)、自動(dòng)化程度低、準(zhǔn)確性差等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了用于鑒定短小乳桿菌的引物序列，該引物能夠特異性擴(kuò)增短小乳桿菌16S?rDNA的部分序列，擴(kuò)增特異性高，能夠準(zhǔn)確、快速鑒定短小乳桿菌。該引物用于鑒定短小乳桿菌過程簡(jiǎn)單，鑒定方法穩(wěn)定、高效，不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且檢測(cè)成本低。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了用于鑒定短小乳桿菌的引物序列，其特征在于：正向引物具有序列表中SEQ?ID?NO：1所述的堿基序列，反向引物具有序列表中SEQ?IDNO：2所述的堿基序列。

本發(fā)明的引物序列可用于鑒定短小乳桿菌，其鑒定過程如下：(1)制備待測(cè)菌株的模板DNA；

(2)使用權(quán)1所述的引物對(duì)步驟(1)制備的模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，在200bp處產(chǎn)生特異性擴(kuò)增條帶的菌株，則鑒定為短小乳桿菌。

其中，制備待測(cè)菌株的模板DNA過程如下：挑取短小乳桿菌的單菌落至50-100微升的超純水中，置于沸水中水浴5-15分鐘，于-80℃凍存15-40分鐘，至沸水中水浴5-15分鐘，4000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，取上清即得模板DNA。

其中，PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，進(jìn)行30次循環(huán)，最后72℃延伸10min。

本發(fā)明電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物采用的為2％的瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色，最后在凝膠成像儀中拍照。

其中，本發(fā)明模板DNA提取中涉及的短小乳桿菌僅為實(shí)驗(yàn)材料，本發(fā)明不限定特定短小乳桿菌菌株，可為現(xiàn)在國內(nèi)外公開或可購買的任何一株短小乳桿菌，也可為任意的自行分離材料，本發(fā)明所用短小乳桿菌購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為：CICC6239，無論任何一株短小乳桿菌均不影響本發(fā)明的實(shí)施；實(shí)施例4電泳中用的干酪乳桿菌，約氏乳桿菌，德氏乳桿菌，羅氏乳桿菌，植物乳桿菌，唾液乳桿菌，彎曲乳桿菌，瑞士乳桿菌等菌株均為對(duì)照菌株實(shí)驗(yàn)材料，不須限定為某株菌株，可根據(jù)需要或可得到的實(shí)驗(yàn)材料選定，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施無影響。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的用于鑒定短小乳桿菌的引物序列能夠特異性擴(kuò)增短小乳桿菌16S?rDNA的部分序列，擴(kuò)增特異性高，能夠準(zhǔn)確、快速鑒定短小乳桿菌。該引物用于鑒定短小乳桿菌過程快速簡(jiǎn)單，鑒定方法穩(wěn)定、高效，不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且檢測(cè)成本低(見表1)。本發(fā)明為短小乳桿菌種質(zhì)資源鑒定提供了檢測(cè)方法，進(jìn)而為篩選短小乳桿菌的優(yōu)良菌株奠定了基礎(chǔ)。

表1現(xiàn)有技術(shù)與本發(fā)明鑒定過程比較

??鑒定時(shí)間??鑒定成本??現(xiàn)有技術(shù)方法??一周左右??約25元??本發(fā)明方法??約2小時(shí)??約3元

附圖說明

圖1為本發(fā)明引物序列在16S?rDNA基因上的位置圖譜；