[發明專利]篩選潛在抗阿留申病水貂的方法

無效

• 申請號: 201010573906.4
• 申請日: 2010-12-06
• 公開（公告）號: CN102154447A
• 公開（公告）日: 2011-08-17
• 發明（設計）人: 邵西群;楊福合;閆喜軍;刑秀梅;章秀婷;柴秀麗;劉琳玲;魯曉萍;榮敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

技術領域

本發明涉及一種篩選潛在抗阿留申病水貂的方法，特別是涉及一種用水貂血樣通過阿留申病毒與腸炎細小病毒PCR鑒別診斷方法準確檢測阿留申病毒核酸，結合對流免疫電泳檢測貂血清的阿留申病毒抗體；是一種對水貂后備留種群進行阿留申病準確篩選的方法。

技術背景

水貂阿留申病至今沒有研制成功預防疫苗，研究發現阿留申病毒與體內被該病毒緩慢刺激產生的高滴度無中和活性的抗體結合，形成病毒與抗體復合物，其中病毒仍可復制；病毒與抗體復合物與血管內皮作用導致自體免疫病(Best?SM,?Bloom?ME.?J?Vet?Med?B?Infect?Dis?Vet?Public?Health,?2005)，貂的不同品種對阿留申病毒的易感性不同，生產實踐中發現抗體陽性，血液循環中無抗原抗體復合物而生產性能良好的抗阿留申病水貂(籍玉林，曲維江，等.國獸醫學報,?1995）。貂群中存在非漸進性阿留申病毒感染貂(Race?RE,?Bloom?ME,?Coe?JE.?J?Immunol,?1983)。我們試驗也發現部分抗體陽性貂血樣中未檢出病毒，顯示抗阿留申病水貂存在。抗阿留申病育種是防制阿留申病的重要途徑。普遍采用的對流免疫電泳檢測通過標準抗原檢測血清中ADV抗體，受檢測時機（病毒感染后抗體產生時期）、抗體的滴度和方法的靈敏度影響，不能檢測初期感染的水貂；完全淘汰抗體陽性個體，去掉抗體陽性抗ADV貂，不利于群體的對阿留申病的抗性，僅保留血清抗體陰性貂，可能積累貂群對病毒的易感性，存在方法的缺陷。國內傳統貂場，阿留申病毒抗體陽性率高，陰性率低。阿留申病毒PCR檢測病毒靈敏度高;阿留申病毒與腸炎細小病毒是親緣病毒，在貂群中常有共同感染，設計兩種病毒的鑒別診斷方法，可準確鑒別阿留申病毒，排除水貂常發腸炎細小病毒對阿留申病毒檢測的干擾。篩選潛在抗阿留申病水貂方法是貂抗阿留申病育種的基礎。聯合使用PCR和CIEP兩種檢測方法，或直接用PCR檢測方法在阿留申病10~12月份季節性發病期(籍玉林,曲維江,等.畜牧獸醫學報,1995),?從水貂后備育種群篩選潛在抗阿留申病水貂。

發明內容

本發明的目的在于提供一種篩選潛在抗阿留申病水貂的方法，從水貂后備留種群篩選出阿留申病毒及血清ADV?抗體均為陰性的未感染貂，血清中阿留申病毒抗體陽性而阿留申病毒陰性的曾感染病毒的康復貂；或直接用PCR檢測只淘汰凈化阿留申病毒陽性的感染貂，保留潛在的抗阿留申病水貂—ADV未感染貂和康復貂，避免了僅用CIEP方法檢測淘汰抗體陽性貂而未感染病毒的水貂；保留潛在抗ADV貂，有利于增強貂群抗病性，擴大育種群數量，為從抗病育種途徑防制阿留申病打下基礎。

本發明的技術方案是這樣實現的：篩選潛在抗阿留申病水貂的方法，其特征在于具體步驟如下：1.1每年11月份前后，對后備留種群的貂逐一編號，趾尖采貂血樣或取貂尿樣；

1.2用改進的蛋白酶K-SDS酚法提取病毒核酸，用核酸助沉劑（Acryl?Carrier）提高阿留申病毒ssDNA的得率；

1.3阿留申病毒與腸炎細小病毒聯合PCR鑒別診斷

所用引物:

par470：parF?5’tgcacaaattgtaacaccttggtc?3’,

parR?5’cacctgttcttagtaagtgtactgg?3’；

adv537：advF?5’catatactccagctgcgccgttg?3’,

advR?5’cctgctggtattatccattcagga?3’。

PCR試驗條件：30ul體系引物終濃度par470?0.15uM，adv537?0.25uM，Mg²⁺?2.0mM,?dNTP??200uM,Taq酶?1U；反應參數：94℃?2min30sec；94℃?32sec，53℃?30sec，72?℃?40sec，32cycles；70℃?4min?10℃?1min；該PCR方法可檢出最低病毒量低于0.3TCID₅₀；用于準確鑒別血液中是否存在阿留申病毒；

1.4同一貂血樣進行阿留申病毒PCR與血清阿留申病毒抗體對流免疫電泳(CIEP)聯合檢測，檢測結果能區分阿留申病毒及貂血清ADV?抗體均為陰性的未感染貂，貂血清中阿留申病毒抗體陽性而阿留申病毒陰性的曾感染病毒的康復貂，阿留申病毒陽性的感染貂；或直接用PCR檢測可區分ADV帶毒貂、未帶毒貂，即可篩選潛在抗ADV貂；