[發明專利]FFPE樣品核酸文庫,其構建方法和FFPE樣品分析方法

有效

• 申請號: 201010571180.0
• 申請日: 2010-12-02
• 公開（公告）號: CN102485979A
• 公開（公告）日: 2012-06-06
• 發明（設計）人: 洪雪玉;劉曉;王冠;張敏紅;張秀清;楊煥明
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司;深圳華大基因研究院
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因組學領域，特別是福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed?paraffin-embedded，FFPE)樣品核酸文庫、其構建方法及一種FFPE樣品的分析方法。?

背景技術

組織樣品的保存多采用福爾馬林固定石蠟包埋的方法，該方法在臨床和科研領域的應用已有一個世紀。數量巨大的歸檔FFPE樣品為回顧性研究，闡明疾病機制，發現治療靶標和指示預后提供寶貴的資源。現階段FFPE樣品僅限于病理學觀察，分子水平的研究正在興起，可行性尚無定論。FFPE樣品的研究極具挑戰，首先，石蠟包埋的醫療樣本十分珍貴，每個樣本總量都很有限且不可替代；其次組織樣品在離體后就開始發生降解，福爾馬林的固定會使組織中的核酸發生不同程度的降解和分子間的交聯，石蠟的高溫滲入過程進一步加速核酸的降解，保存的時間及環境對樣品中的核酸也有巨大的影響。因此如何從有限的且容易發生核酸降解的FFPE樣本中成功提取可用于后續反應的核酸成為其用于分子水平回顧性研究的關鍵。?

第二代測序技術(next?generation?sequencing，NGS)，例如SOLEXA、SOLID、和454測序平臺等^[1]，大大提高了測序速度，同時測序成本顯著降低。但某些全基因組測序項目的費用還未達到人人都能承受的水平，因此選取感興趣的目標區域，通過特定的方法富集目標區域后測序，能大大降低測序成本，縮短研究周期，集中精力深度挖掘數據。人類全基因組的大小約為3Gb，其中蛋白編碼序列僅占1％，約30Mb，以散在分布的外顯子形式存在，約18萬個。人類基因組的突變主要集中在外顯子，占85％，且外顯子的突變與疾病的發生密切相關，因此，選擇性?的測定外顯子序列是一個高效的研究人類疾病的策略。外顯子測序是富集全基因組中的外顯子，而后進行測序的技術，其富集方法有NimbleGen的基于DNA微陣列的固相雜交和Agilent的Sureselect液相雜交技術等。利用外顯子測序技術可高效地對多份FFPE樣本的外顯子序列進行測定，并對外顯子區域的變化進行分析，從而找到與疾病發生相關的基因，為疾病的預防、診斷和治療提供依據。?

由于FFPE樣本的特殊性，目前尚未有FFPE樣本可否用于外顯子捕獲測序的論證，并且也沒有相應方法的報道。雖然已經有許多商品化的FFPE樣本DNA提取試劑盒，如Ambion公司的RecoverAll?Total?Nucleic?Acid?Isolation?Kit，QIAGEN公司的?DNA?FFPE?Tissue?Kit等。DNA提純的主要步驟包括二甲苯脫蠟，乙醇去除二甲苯，組織裂解緩沖液和蛋白酶K消化組織，高溫幫助恢復分子交聯以及DNA純化。完全按照試劑盒的方法提取的FFPE核酸并不能很好地用于某些分子水平的研究^[2]。?

發明內容

發明人面對現有技術的缺陷，通過提供一種FFPE樣本核酸文庫及其構建方法，建立了將核酸測序技術和目標序列捕獲技術用于分析FFPE樣本的方法。?

本發明的一個方面提供了一種FFPE樣本核酸文庫的構建方法，包括以下的步驟：?

步驟一FFPE樣本核酸的提取；?

步驟二核酸片段化?

片段化的方法包括霧化、超聲片段化、HydroShear或酶切處理，從而將核酸打斷為大小為200-300bp的片段；?

步驟三DNA片段末端修復及3’端連接“A”堿基；?

步驟四接頭的連接?

將末端連接“A”堿基的DNA隨機片段末端連接序列已知的接頭；?

步驟五片段選擇?

將連接產物進行瓊脂糖電泳，選擇350-400bp進行切膠純化；?

步驟六PCR擴增?

根據已知的接頭序列設計引物，進行PCR擴增，即得到FFPE樣本核酸文庫。?

本發明提供的FFPE樣本核酸文庫的構建方法的一個實施例中，步驟一所述核酸的提取包括以下步驟：