[發明專利]FFPE樣品核酸文庫,其構建方法和FFPE樣品分析方法

有效

• 申請號: 201010571180.0
• 申請日: 2010-12-02
• 公開（公告）號: CN102485979A
• 公開（公告）日: 2012-06-06
• 發明（設計）人: 洪雪玉;劉曉;王冠;張敏紅;張秀清;楊煥明
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因科技有限公司;深圳華大基因研究院
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種FFPE樣本核酸文庫的構建方法，包括以下的步驟：

步驟一FFPE樣本核酸的提取；

步驟二核酸片段化

片段化的方法包括霧化、超聲片段化、HydroShear或酶切處理，從而將核酸打斷為大小為200-300bp的片段；

步驟三DNA片段末端修復及3’端連接“A”堿基；

步驟四接頭的連接

將末端連接“A”堿基的DNA隨機片段末端連接序列已知的接頭；

步驟五片段選擇

將連接產物進行瓊脂糖電泳，選擇350-400bp進行切膠純化；

步驟六PCR擴增

根據已知的接頭序列設計引物，進行PCR擴增，即得到FFPE樣本核酸文庫。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟一所述核酸的提取包括以下步驟：

FFPE樣本切片，切片浸于二甲苯或右旋檸檬烯中去除石蠟，振蕩混勻后離心去除上清；用無水乙醇洗滌以去除二甲苯或右旋檸檬烯，離心去除上清；每10mg組織加200-500ul加裂解緩沖液和1-3mg蛋白酶K，在消化期間添加2-4次蛋白酶K，50-60℃消化15-20小時；消化后75-95℃孵育30-60分鐘；對所得DNA進行純化；

所述裂解緩沖液成分：10-50mmol/L?Tris-HCl，pH?7.4；100-500mmol/LnaCl；5-20mmol/LEDTA，pH?8.0；1-2％重量SDS。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟一所述核酸的提取包括以下步驟：

FFPE樣本切片2-10微米，切片浸于二甲苯或右旋檸檬烯中去除石蠟，振蕩混勻后離心去除上清；用無水乙醇洗滌以去除二甲苯或右旋檸檬烯，離心去除上清；每10mg組織加300ul加裂解緩沖液和1.5mg蛋白酶K，在消化期間添加2-4次蛋白酶K，56℃消化16小時；消化后90℃孵育45分鐘；所得DNA進行純化；

所述裂解緩沖液成分：10mmol/LTris-HCl，pH?7.4；150mmol/LnaCl；10mmol/L?EDTA，pH?8.0；1.5％重量SDS。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟二所述片段化使用超聲的方法，打斷至目的大小為250-300bp；優選使用Covaris超聲打斷儀打斷，模式選擇Frequency?Sweeping?mode，，打斷參數為DutyCycle?10％，Intensity?5，Cycles?per?Burst?200，共打斷2-3次，每次打斷時間為60-110秒，優選75秒。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟六所述PCR擴增，其中退火及延伸時間為40-60秒，循環數為6-10個。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：所述退火及延伸時間為45秒。

7.權利要求1-6所述任一種方法構建所得的文庫。

8.一種分析FFPE樣品的方法，包括構建權利要求7所述文庫的步驟。

9.根據權利要求8所述的方法，還包括對所述文庫進行核酸測序的步驟。

10.根據權利要求8所述的方法，還包括捕獲所述文庫中的目標序列，并對所捕獲的序列進行核酸測序的步驟；所述目標序列種類包括外顯子序列。