[發明專利]一種快速鑒別和檢測肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法和試劑盒

無效

• 申請號: 201010570231.8
• 申請日: 2010-12-02
• 公開（公告）號: CN102021246A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 艾琳;陳木新;林瑞慶;李淳;宋慧群;袁子國;李娟;李海龍;朱興全
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明涉及采用LAMP方法快速區分肝片吸蟲和大片吸蟲的鑒別技術。

背景技術

?片形吸蟲病是牛、羊最主要的寄生蟲病之一。它是由寄生于黃牛、水牛、山羊、綿羊等各種反芻動物肝臟膽管中的肝片形吸蟲和大片形吸蟲所引起的，豬、馬屬動物及野生動物也可寄生，并且可寄生于人。該病能引起急性或慢性的肝炎和膽管炎，并繼發全身性的中毒和營養障礙，常引起犢牛和綿羊的大批死亡。本病呈地方性流行，多發生在低洼、潮濕的放牧地區。

?肝片吸蟲和大片吸蟲形態極其相似。長期以來，兩者的分類鑒定主要依據成蟲的形態、生活史、流行病學等特征來進行，但由于片形吸蟲種類個體差異較大，同一蟲種又因宿主的種類、宿主的反應的不同而有一定差異，導致蟲體的形態不很規則，用傳統的形態學分類方法有時就有局限性，對于這兩種吸蟲的尾蚴和蟲卵的鑒定就更加困難。近年來，一些學者分析了片形吸蟲染色體的核型和同工酶的多態性，但染色體核型的研究結果存在一些矛盾，有人認為肝片吸蟲染色體組成為3n=30，大片吸蟲染色體組成2n=20，但也有相反的結果。

分子遺傳學分析為片形吸蟲分類的研究提供了新的途徑。黃維義等應用PCR-RFLP對來自廣西、四川、黑龍江、法國等地的片形吸蟲進行分析，用限制性內切酶Hsp92Ⅱ、RcaⅠ酶切核糖體DNA第二內轉錄間隔區(ITS-2)的完整的PCR產物，結果顯示，兩種酶的酶切帶型在種內無差異，但在種間卻均有一定的差異。胥全彬等應用RAPD技術鑒別南京市的片形吸蟲非典型形態蟲體，鑒定為形態不典型的大片吸蟲。但以上技術操作起來需要PCR儀等比較昂貴的儀器，所以在大批量樣本檢測和蟲卵及尾蚴樣本分型時比較費時費力。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated?isothermal?amplification?,?LAMP)是Notomi?等在2000年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)?在等溫條件（65?℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。

但是，由于現有的環介導等溫擴增技術對操作環境要求很高，實驗耗費也較高，尤其是其中使用的SYBR?green?I染料較貴，現有片形吸蟲的蟲種鑒定通常是通過獲取成蟲樣本觀察其形態來確定，目前還未見環介導等溫擴增技術?(Loop-mediated?isothermal?amplification?,?LAMP)應用于片形吸蟲蟲種的鑒定，也未見環介導等溫擴增技術應用于片形吸蟲病的快速檢測和防控檢測的技術報道。

發明內容

本發明的目的是填補環介導等溫擴增技術應用于片形吸蟲病的快速檢測和防控檢測的技術空白，提供一種快速區分肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法，突破現有技術在片行吸蟲研究方面存在的技術限制。

本發明的另一個目的是提供實現上述檢測方法的LAMP試劑盒。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

提供一種快速區分肝片吸蟲和大片吸蟲的LAMP檢測方法，包括以下步驟：

??（1）肝片吸蟲和大片吸蟲成蟲、尾蚴或蟲卵DNA的提取；

????成蟲樣本取自牛或羊；尾蚴樣本取自椎實螺；蟲卵樣本取自羊或牛的糞便；?

（2）采用特異性檢測引物應用恒溫加熱器技術（LAMP）進行擴增；

??（3）將擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈下觀察。

??本發明步驟（3）也可以將產物經SYBR?green?I?顯色液顯色后，在凝膠成像系統下觀察。

步驟（1）所述DNA的提取：蟲體材料置于1.5mL的離心管中，用雙蒸水反復吹打沖洗3次，移去離心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白質釋放基因組DNA，56℃過夜消化15～18h；消化好的蟲體懸液按Promega試劑盒Wizard^??SV?Genomic?DNA?purification?system使用說明提取蟲體DNA，直接使用或于-20℃冰箱保存備用。

尾蚴DNA的提取方法為將宿主螺用滅菌雙蒸水反復洗5次，用兩個載玻片將其壓碎，去掉外面的螺殼，螺肉內尾蚴的提取方法參照蟲體的提取方法。