[發明專利]一種快速分離骨髓間充質干細胞的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201010569165.2
• 申請日: 2010-11-26
• 公開（公告）號: CN102041243A
• 公開（公告）日: 2011-05-04
• 發明（設計）人: 楊仕明;秦賀;趙立東;翟所強;郭維維;孫建和;楊偉炎
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 祁建國;梁揮

技術領域

本發明屬于組織工程領域，具體地，涉及一種快速分離骨髓間充質干細胞的試劑盒、該試劑盒的應用以及一種快速分離骨髓間充質干細胞的方法。

背景技術

骨髓間充質干細胞是一類具有多向分化潛能的成體干細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞、肝細胞等多種組織細胞，在臨床上應用于組織工程、基因治療、細胞因子替代治療等領域。然而，骨髓間充質干細胞僅占骨髓內成核細胞總數的0.001％～0.01％，并且隨著年齡的增長而減少。應用骨髓間充質干細胞進行進一步實驗的前提條件是快速實現骨髓間充質干細胞的擴增分離。

目前，對骨髓間充質干細胞的分離培養、擴增還沒有統一的標準?，F階段用于骨髓間充質干細胞的分離培養方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞術法和免疫磁珠法。密度梯度離心法主要根據細胞不同密度來分離細胞群落。流式細胞術法和免疫磁珠法利用骨髓間充質干細胞對一定數目抗體的反應性從而通過表達抗體的陽性選擇來獲得。貼壁篩選法是最早也是最簡單的分離方法，但存在純度低、培養時間長等缺點。以前的研究對貼壁篩選法進行了深入的探討，其中包括采用不同的培養液，選擇不同的換液方式等。然而現有的實驗仍然存在一定的不足，例如培養液的配制過于復雜、原代培養時間仍然過長、細胞的純度不高等。

發明內容

為了解決骨髓間充質干細胞分離的純度、數量和時間問題，本發明提供了一種快速分離骨髓間充質干細胞的試劑盒。利用此試劑盒，能有效純化哺乳動物骨髓間充質干細胞，快速獲得大量骨髓間充質干細胞，以利于進行下一步的實驗研究。

根據本發明的一個方面，本發明的快速分離骨髓間充質干細胞的試劑盒包括洗滌液，細胞培養液A，細胞培養液B和細胞消化液，其中：

所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液溶液；

所述細胞培養液A為α-MEM液體培養基；

所述細胞培養液B為胎牛血清；

所述細胞消化液為胰蛋白酶液。

根據本發明的一個方面，所述骨髓間充質干細胞源自哺乳動物。

根據本發明的一個方面，所述洗滌液、培養液A、培養液B以及細胞消化液是無菌的。

根據本發明的一個方面，所述洗滌液、培養液A、培養液B以及細胞消化液為獨立包裝。

根據本發明的一個方面，用于骨髓間充質干細胞的培養的細胞培養液是將細胞培養液A與細胞培養液B按照9∶1體積比配制的細胞培養混合液。

根據本發明的一個方面，所述磷酸鹽緩沖液可為0.01M，所述細胞消化液可為質量/體積百分比濃度為0.25％。

本發明的另一目的在于提供了一種快速分離骨髓間充質干細胞的方法。該方法用洗滌液沖洗骨髓腔得到細胞，經原代培養，傳代培養最終獲得分離的骨髓間充質干細胞。

根據本發明的一個方面，所述快速分離骨髓間充質干細胞的方法可通過下述步驟實現的：將得到的細胞在細胞培養混合液中貼壁培養，培養24小時后半量更換細胞培養混合液，培養獲得原代培養的骨髓間充質干細胞；利用洗滌液沖洗獲得的骨髓間充質干細胞，隨后用細胞消化液對其進行消化，經細胞混合液傳代培養至細胞密度達到90％；以及再次利用細胞消化液對經傳代培養的骨髓間充質干細胞進行消化，獲得分離的骨髓間充質干細胞。

本發明的方法采用培養24小時首次半量換液方法，利用存在于原培養液中造血干細胞的旁分泌作用，既部分地清除了大量未貼壁的造血系細胞，又保證了骨髓中其他細胞分泌的細胞因子對骨髓間充質干細胞的滋養作用，從而確保了細胞培養和傳代過程中的生長和純化效果。

根據本發明的一個方面，所述快速分離骨髓間充質干細胞的方法可包括：

1、骨髓間充質干細胞的原代分離培養：

利用洗滌液將細胞從骨髓腔內沖出，收集、離心、棄去上懸液，用細胞培養混合液充分吹打成單細胞懸液，接種培養。接種24小時后，半量換液，繼續培養，以后每3天更換一次細胞培養混合液。7天即可完成原代培養。

2、骨髓間充質干細胞的傳代培養：

棄除原代培養的培養混合液，用洗滌液充分清洗細胞，去除懸浮在貼壁細胞表面的圓形細胞，加入細胞消化液，待細胞回縮、細胞間隙增大時，加入細胞培養混合液，充分吹打、離心、棄上清液、加入細胞培養混合液、接種、培養。

3、骨髓間充質干細胞的收獲：

細胞密度達到90％，棄去原培養液，加入細胞消化液進行消化，收獲培養的骨髓內的間充質干細胞。

附圖說明

圖1是原代骨髓間充質干細胞培養7天后的細胞觀察圖；

圖2是原代骨髓間充質干細胞傳代培養后的細胞形態觀察圖；和