[發明專利]一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201010567807.5
• 申請日: 2010-11-30
• 公開（公告）號: CN101974650A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 李園;曹坳程;郭美霞;崔瑞;吳篆芳;趙海濱
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明涉及農作物病害診斷與防治技術，特別是一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法及試劑盒。

背景技術

尖孢鐮刀菌(Fusarium?oxysporum)主要在土壤里越冬(夏)，且在土壤里存活時間較長，一般是通過土壤、肥料、灌溉水等進行傳播，以侵染危害植株地下部位的根莖為主，且能侵染植物的維管束，病原物在維管束里繁殖，阻塞其輸送營養物質，在短期內致使整株植物枯萎而死亡。

尖孢鐮刀菌可嚴重危害瓜類、茄科類、豆科蔬菜及草莓等經濟作物，主要引起根腐、莖腐、果腐等，有的侵染植物維管束組織引起萎蔫癥。病原菌以菌絲體、厚垣孢子在土壤中越冬，且在土壤中可以腐生。厚垣孢子在土壤中能生存5～10年。

尤其在保護地農作物種植栽培過程中，尖孢鐮刀菌引致的土傳病害的發生越來越嚴重。因其發生具有隱蔽性，大多在結果期才達到發病的高峰期，因此損失巨大。嚴重影響了保護地的發展與人民的經濟收入。

傳統鑒定方法通常采用選擇性培養基進行病原菌的分離培養，菌落形態觀察，顯微鏡下觀察病菌的菌絲體，孢子等特征，結合田間發病植株癥狀的觀察進行分類。傳統鑒定方法在很多方面存在一定誤差和困難，尤其是對土傳病原菌的準確鑒定具有很大局限性。僅菌絲體和孢子等的形態特征也即表型分析來鑒別，有時是不準確的。同一病原菌的菌落往往在形態上、分布、生理性狀等方面存在一定差異，難以進行準確鑒定。隨著分子生物學技術的日益成熟和廣泛應用，人們有可能避開傳統的分離培養過程，通過DNA水平上的研究，對土壤中病原菌進行鑒定。分子生物學方法的簡便、快速、高效、可靠等特點，是傳統的分離培養方法所達不到的。

定量PCR是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術(real-time?fluorescent?quantitative?PCR，FQ-PCR)是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監測整個PCR進程，通過擴增產物熔解曲線分析可以特異地檢測和鑒定某種病原真菌，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域，但在農業植物病原真菌的定性定量檢測研究中應用較少，尤其是在尖孢鐮刀菌的定性定量研究中。

發明內容

本發明根據上述領域的不足，提供一種采用PCR檢測尖孢鐮刀菌的方法和試劑盒，能夠提高了檢測的準確性，節約了檢測時間，試劑盒可以在植物病害診斷與防治領域大規模推廣。

一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法，包括如下步驟

(1)預制PCR體系，

(2)在預制好的PCR體系中加入模板得到PCR反應體系，

(3)進行PCR擴增反應；

其特征在于，所述PCR反應體系中的引物的序列信息如下：

Fo1：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

Fo2：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。

所述PCR反應體系為：10×PCR?buffer?2μL，15mM?MgCl₂?0.5μL，2.5mM?dNTPs?1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶1U，DNA模板1μL，其余為滅菌雙蒸水，終體積為20μL。

所述PCR擴增反應的程序為：94℃預變性3min；94℃變性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環；最后72℃延伸10min。

所述PCR方法為熒光定量PCR方法。

所述PCR反應體系為：

反應總體積為20μL，SYBR?Green?Supermix?10μL，10μM/L的Fo1?1μL，10μM/L的Fo21μL，模板11μL，余量為無菌雙蒸水。

所述PCR擴增反應的程序如下：

第一步：95.00℃3分鐘，1個循環；

第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分鐘，45個循環；

第三步：55.0℃10分鐘，95.0℃1分鐘，1個循環；

第四步：55.0℃1分鐘；

第五步：55.0℃10秒，80個循環。

一種檢測尖孢鐮刀菌的PCR方法的試劑盒，其特征在于包含有具有如下序列信息的引物：

Fo1：5’-CGTCATTTCAACCCTCAAGCA-3’

Fo2：5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAT-3’。