[發明專利]一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法

有效

• 申請號: 201010567727.X
• 申請日: 2010-11-30
• 公開（公告）號: CN102021158A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 沈紹傳;贠軍賢;姚克儉
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;俞慧

(一)技術領域

本發明涉及一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，尤其是利用一種晶膠吸附層析技術從蛋清中分離溶菌酶(Lysozyme)的方法。

(二)背景技術

溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁溶解酶，因能夠水解某些細菌中的黏多糖而被廣泛應用于食品防腐劑、生物工程和抗菌劑等方面。國外報道已經通過動物的體外細胞培養實驗證實溶菌酶是一種潛在的抗癌藥物。

溶菌酶廣泛存在于高等動物組織及分泌物、植物和微生物體內，其中蛋清和哺乳動物的乳汁是溶菌酶的重要來源。雞蛋作為生產原料優勢在于原料豐富、廉價且雞蛋清中溶菌酶的含量最高(約3.2％-3.5％)。從蛋清中提取溶菌酶的工業化技術比較復雜，通常需要幾種技術聯合使用，如：重復結晶、鹽析、超濾、陽離子交換層析等。結晶法是目前工藝上提取蛋清中溶菌酶的首選方法，但需要通過反復結晶精制，其過程繁瑣且生產周期長。常規陽離子交換樹脂吸附層析溶菌酶，因其介質孔隙尺寸在納米級范圍，傳質主要通過分子擴散，吸附平衡時間長，過程成本較高。本發明所用的陽離子交換型晶膠介質層析其傳質利用對流擴散，傳質阻力小，實現了溶菌酶的快速高效分離。

(三)發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種用晶膠吸附層析技術快速高效提取溶菌酶的新方法。

為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：

一種溶菌酶的晶膠吸附層析分離方法，包括如下步驟：

(1)用pH值6.0～10.5的緩沖溶液稀釋含有溶菌酶的混合液得到上樣液，以0.1～25cm/min的流速上晶膠床柱，進行吸附；

(2)以去離子水或pH值6.0～10.5的緩沖溶液為沖洗液，沖洗掉晶膠內未被吸附的雜質；

(3)用含有0.02～3M堿金屬鹽的pH值6.0～10.5的緩沖溶液為洗脫液，進行洗脫，收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶。

在所述的晶膠吸附層析分離過程中，通常在上樣前，先以pH值6.0～10.5的緩沖溶液平衡晶膠床柱。

進一步，步驟(1)所述晶膠床柱中的晶膠介質優選為陽離子交換型，其功能基團為磺酸基。所述的陽離子交換晶膠介質的基質制備方法參照文獻(Yao?etal.，Chem.Eng.Sci.61，6701-6708，2006)；基質孔內接枝聚合反應及所用陽離子交換功能基團的磺酸基單體參照專利(CN100413590C)。本發明對上述兩篇文獻做全文引用。

進一步，步驟(1)中所述的含有溶菌酶的混合液為雞蛋清或預處理后的雞蛋清。所述的預處理后的雞蛋清是指先用0.1～1M的鹽酸溶液將蛋清的pH調至6.0-7.0，離心后將其上清液的pH用0.1～1M的氫氧化鈉溶液調至7.0～10.0范圍，再次離心后的上清液。通常是將含有溶菌酶的混合液稀釋2～10倍，然后低溫攪拌、離心得到上清液作為上樣液。

進一步，步驟(2)中所述沖洗液的流速在0.1～25cm/min。

進一步，步驟(3)中的洗脫優選梯度洗脫，洗脫液流速0.2～20cm/min，先用含堿金屬鹽0.02～0.15M的pH值6.0～10.5的緩沖溶液進行洗脫，再用堿金屬鹽含量相應更高(0.15～3M)的pH值6.0～10.5的緩沖溶液進行洗脫，收集含溶菌酶的洗脫峰，得到所述的溶菌酶。

進一步，步驟(3)所述的堿金屬鹽優選NaCl或KCl。

本發明所述的pH值6.0～10.5的緩沖溶液可選自下列之一：①pH?6.0～8.0磷酸鹽緩沖溶液、②pH?7.1～9.0Tris-鹽酸緩沖溶液、③pH?9.1～10.5碳酸鹽緩沖溶液。

本發明在步驟(3)洗脫完畢后，依次用0.1M?HCl、1～2M?NaCl和去離子水對使用過的晶膠床柱進行再生。

本發明具體推薦所述方法按照如下步驟進行：

(a)以pH值6.0～10.5的緩沖溶液平衡晶膠床柱；所述晶膠床柱中的晶膠介質為陽離子交換型，其功能基團為磺酸基；

(b)用pH值6.0～10.5的緩沖溶液稀釋雞蛋清或預處理后的雞蛋清得到上樣液，以0.1～25cm/min的流速上晶膠床柱，進行吸附；

(c)以去離子水或pH值6.0～10.5的緩沖溶液為沖洗液，以0.1～25cm/min的流速沖洗掉晶膠內未被吸附的雜質；