[發(fā)明專利]構(gòu)建應(yīng)用于高質(zhì)量噬菌體抗體庫的表達(dá)載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010565730.8
• 申請(qǐng)日: 2010-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN102094035A
• 公開（公告）日: 2011-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 童貽剛;安小平;米志強(qiáng);潘博;王曉娜;張寶中
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N5/10;C12N7/01;C07K16/18
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建應(yīng)用于高質(zhì)量噬菌體抗體庫的表達(dá)載體。

背景技術(shù)

噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為抗體技術(shù)領(lǐng)域帶來了巨大的變化，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域，通過基因工程和噬菌體展示技術(shù)的結(jié)合，能得到人源化的針對(duì)幾乎所有抗原表位的抗體，這極大地推動(dòng)了各種性能優(yōu)良抗體及多功能抗體融合蛋白的開發(fā)和應(yīng)用。噬菌體抗體庫模擬了天然抗體庫，使得人們可以不經(jīng)過復(fù)雜的免疫過程，而是直接利用抗原就可以從抗體庫中篩選出特異性抗體成為可能。它既解決了人源性單抗的來源困難、人體雜交瘤系統(tǒng)的低效及鼠單抗的動(dòng)物源性等難題，也使得單克隆抗體的制備變得簡(jiǎn)單易行，穩(wěn)定有效，使人單克隆抗體的制備有了突破。但是，此技術(shù)目前還有許多問題尚待解決，如在保證抗體庫的多樣性和呈現(xiàn)效率的同時(shí)，如何提高有效庫容量、如何在構(gòu)建抗體庫時(shí)提高抗體基因連接效率等問題上，還有待進(jìn)一步解決。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種載體。

本發(fā)明提供的載體，按照如下方法制備：

1)將SacB的編碼基因1插入到pDF的多克隆位點(diǎn)間，得到中間載體PSBX；

2)將步驟1)得到的中間載體PSBX的BssHII酶切位點(diǎn)改為BglII酶切位點(diǎn)，得到中間載體PSGX；

3)將SacB的編碼基因2插入到步驟2)得到的中間載體PSGX的Nhe?I和NcoI酶切位點(diǎn)間，得到載體pDF-D-SacB；

所述SacB的編碼基因1為序列表的序列1自5’末端第30-1908位核苷酸；

所述SacB的編碼基因2為序列表中的序列2自5’末端第7-1857位核苷酸。

步驟1)中，所述將SacB的編碼基因1插入到pDF的多克隆位點(diǎn)為將SacB的編碼基因1插入到pDF的BssHII和Xba?I酶切位點(diǎn)間。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種載體。

本發(fā)明提供的載體按照如下方法制備：

1)以puc19-SacB為模板，用引物對(duì)1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物1，將PCR產(chǎn)物1插入到pDF的BssHII和Xba?I酶切位點(diǎn)間，得到中間載體PSBX；所述PCR產(chǎn)物1即為SacB的編碼基因1，所述SacB的編碼基因1為序列表的序列1自5’末端第30-1908位核苷酸；

所述引物對(duì)1中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列5，所述引物對(duì)1中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列6；

2)將步驟1)得到的中間載體PSBX上的BssHII酶切位點(diǎn)改變?yōu)锽glII酶切位點(diǎn)，得到中間載體PSGX；

3)以pUC19-SacB為模板，用引物對(duì)2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物2，將得到的PCR產(chǎn)物2插入到步驟2)得到的中間載體PSGX的Nhe?I和Nco?I位點(diǎn)間，得到重組載體pDF-D-SacB；所述PCR產(chǎn)物2即為SacB的編碼基因2，所述SacB的編碼基因2為序列表中的序列2自5’末端第7-1857位核苷酸；

所述引物對(duì)2中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列7，所述引物對(duì)2中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列8。

上述將BssHII酶切位點(diǎn)改為BglII酶切位點(diǎn)按照如下方法進(jìn)行：

A：將中間載體PSBX用BssHII酶切后，再加入堿性磷酸酶去磷酸化，得到去磷酸化的PSBX線性片段；B：將含有BglII的引物對(duì)在98℃-20℃進(jìn)行退火，得到退火的引物對(duì)，再向退火的引物對(duì)進(jìn)行磷酸化處理，得到磷酸化的退火引物對(duì)；

C：將磷酸化的退火引物對(duì)和去磷酸化的PSBX線性片段連接，得到中間載體PSGX；

所述含有BglII的引物對(duì)中的一條引物為序列表中的序列3，另一條引物為序列表中的序列4。

所述將含有BglII的引物對(duì)在98℃-20℃進(jìn)行退火，具體為將含有BglII的引物對(duì)在98℃、90℃、80℃、70℃、60℃、50℃、40℃、30℃和20℃進(jìn)行退火。

含有所述的載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或重組病毒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述的載體或所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或重組病毒在制備噬菌體抗體庫中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述應(yīng)用中，所述抗體為抗乙肝表面抗原抗體。