[發明專利]一種產抗真菌蛋白菌株的篩選方法及應用

有效

• 申請號: 201010565301.0
• 申請日: 2010-11-30
• 公開（公告）號: CN102086440A
• 公開（公告）日: 2011-06-08
• 發明（設計）人: 宋緒磊;陳洪元;李建飛;宋濤;孫志偉;江偉;唐坤甜
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P21/02;C12C1/16
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一株產抗真菌蛋白的菌株，命名為Aspergillus?giganteus?AF-11，已于2010年11月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC?NO.4342。同時涉及獲得該菌的誘變篩選方法和利用該菌株發酵抗真菌蛋白并在啤酒大麥制麥中的應用的方法，屬于微生物制麥技術領域。?

背景技術

AFP(antifungal?protein)是由Aspergillus?giganteus分泌的小分子量堿性蛋白，可有效抑制絲狀真菌的生長，尤其是動植物致病真菌。近幾年的研究發現AFP對抑制絲狀真菌具有安全、高效、廣譜、穩定的特點，而這些顯著的特點使其最有希望成為新的抗真菌抗生素、安全的天然食品防腐劑、可靠的生物農藥和基因工程目的基因載體。1965年，Olson等從美國密歇根州農場土壤中分離篩選得到的一株Aspergillus?giganteus菌株并發酵液中分離得到一種由51個氨基酸組成的小分子堿性蛋白——AFP(抗真菌蛋白)，并證明對絲狀真菌具有明顯的抑制作用。研究還發現AFP可高效抑制許多人類和動植物致病霉菌，而對細菌和酵母菌無抑制作用，這種選擇性抑制作用在醫學和應用生物技術上引起了人們的廣泛興趣和高度關注。2006年，Szappanos等研究分析了AFP對哺乳動物細胞功能的影響，通過實驗發現AFP對哺乳動物細胞無細胞毒素效應和免疫反應，并認為AFP是具有很好應用前景和開發研究價值的新的抗真菌抗生素。?

目前，啤酒大麥在制麥過程由于潮濕的環境容易污染鐮刀霉、煙曲霉和根霉等真菌。這些受污染的麥芽不但影響釀造性能還影響食品安全，目前一般采用制麥過程中加入石灰水來抑制菌的污染，但是這樣也會帶來食品安全的隱患。利用微生物自身產生的抗真菌蛋白來抑制污染很少有報道，尤其是關于Aspergillus?giganteus的研究更是幾乎沒有看到。?

發明內容

本發明的目的是提供一株能廣譜抗真菌的高產AFP菌株及其篩選方法。同時利用該菌株發酵生產AFP的方法在制麥過程中進行有害微生物控制。本發明的目的可以通過以下措施達到：?

1、土壤樣品取樣及前處理：取堿性土壤2g，用水浴、乙醇和蛋白胨處理。?

2、真菌培養：在28℃，篩選培養基(葡萄糖10g，NH₄NO₃1g/L，酵母膏1g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5g/L，孟加拉紅0.006g/L，鏈霉素0.003g/L，瓊脂20g/L。)培養4-5天后，挑選可以抑制其它霉菌生長的菌株。?

3、馴化誘變：30℃條件下，將篩選的菌株YPD培養基上馴化培養4-5天，然后經EMS?誘變，挑選抑菌圈較大的菌株作為復篩菌株。?

4、搖瓶復篩：搖瓶發酵，采用紙片法或者牛津杯法檢測發酵液菌株抑菌圈大小。?

5、選出抑菌能力最強的菌株，發酵生產AFP，用考馬斯亮藍比色法測定AFP含量。?

6、將AFP用于啤酒大麥的制麥過程中，抑制菌的污染。?

本發明取得以下優點和顯著進步：?

1、得到了一株高產抗真菌蛋白的菌株，保藏號為CGMCC?NO.4342。?

2、將該菌株發酵生產AFP用于啤酒大麥的制麥過程中，抑制菌的污染，減少了食品加工過程中化學試劑石灰水的加入，用生物的手段更加安全環保的解決了制麥污染問題。?

具體實施方式

實施例1產抗真菌蛋白菌株的篩選?

1、1.5g土樣加入10ml無菌生理鹽水，在60℃條件下，水浴30min?

2、去除無菌水，加入65％乙醇處理10min，加入0.1％濃度的蛋白胨溶液處理10min。?

3、將0.1ml溶液接種到肌氨酸蔗糖培養基，25℃條件下，培養7天。?

4、挑選不同形態特征的單菌落，轉接到MEA(蔗糖25g/L，硝酸鈉1.5g/L，磷酸氫二鉀0.6g/L，氯化鉀0.4g/L，硫酸鎂0.3g/L，硫酸亞鐵0.08g/L，瓊脂20g/L)斜面固體培養基上。?

5、用10％甘油收集并保藏單菌落的孢子。?

6、分離的單菌落在MEA培養基pH4.525℃條件下培養4天。?

7、打孔器挖取直徑25mm的菌苔，移至已滅菌的培養皿中，每皿三塊。?