[發明專利]一種產抗真菌蛋白菌株的篩選方法及應用

有效

• 申請號: 201010565301.0
• 申請日: 2010-11-30
• 公開（公告）號: CN102086440A
• 公開（公告）日: 2011-06-08
• 發明（設計）人: 宋緒磊;陳洪元;李建飛;宋濤;孫志偉;江偉;唐坤甜
• 申請（專利權）人: 中國食品發酵工業研究院
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P21/02;C12C1/16
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種抗真菌蛋白生產菌株，其分類命名為Aspergillus?giganteus?AF-11，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?NO?4342。鑒定其為巨大曲霉的一個亞種，與一般巨大曲霉存在形態上存在明顯差異，具體表現為分生孢子囊短而小，長度約為一般巨大曲霉的2/3；體積同樣比一般巨大曲霉??；分生孢子梗比一般巨大曲霉短。

2.如權利要求1所述一種抗真菌蛋白生產菌的選育方法，包括以下步驟：

(1)土樣處理：將土樣進行水浴，乙醇，蛋白胨選擇性富集處理。

(2)真菌培養：經富集處理的樣品28℃條件下，在篩選培養基上培養4-5天

(3)菌種篩選：挑選可以抑制其他霉菌生長的菌落。

(4)菌種馴化：30℃在YPD培養基上馴化培養4-5次。

(5)誘變篩選：經EMS誘變，挑選抑菌圈較大的菌株，作為復篩菌株。

(6)菌種復篩：搖瓶發酵，檢測發酵液的對靶標菌抑菌圈大小。

(7)培養優化：溫度，碳源，氮源，檢測抗真菌蛋白(AFP)產量和效價。

3.如權利要求2所述(1)中土樣處理方法，其處理步驟為：

(1)采集土壤樣品，烘干，4℃冰箱保存。

(2)取2g土壤樣品研碎，勻質，加入10mL無菌生理鹽水，混勻，50℃條件下水浴45min。

(3)去除生理水，加入5mL65％乙醇處理10min。

(4)將處理的樣品加入0.1％濃度的蛋白胨溶液處理10min。

4.如權利要求2所述(2)中所用篩選培養基組成如下：

葡萄糖10g，NH₄NO₃1g/L，酵母膏1g/L，K₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O?0.5g/L，

孟加拉紅0.006g/L，鏈霉素0.003g/L，瓊脂20g/L。

5.一種通過權利要求1所述菌種發酵生產AFP的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成：

(1)斜面培養：菌種在28℃條件下，培養4～5天，待孢子成熟后，用無菌水洗脫孢子，制成孢子懸液用于種子培養。

(2)種子培養：種子培養基滅菌后，冷卻后按5％～10％的接種量，置于30℃、轉速為150～220rpm的搖床上。培養48～60小時后的菌株用于發酵培養基接種。

(3)發酵培養：搖瓶發酵培養：發酵培養基滅菌后，冷卻后按照10～25％的接種量接入種子培養的菌株，置于32℃、轉速為150～220rpm的搖床上，發酵培養72～96小時后，分離提取AFP。

6.如權利要求5所述的方法(1)中斜面培養基組成如下：

蔗糖20～30g/L，硝酸鈉1～2g/L，磷酸氫二鉀0.5～1g/L，氯化鉀0.2～0.5g/L，硫酸鎂0.2～0.5g/L，硫酸亞鐵0.005～0.01g/L，瓊脂20g/L。

發酵培養基：牛肉膏10～15g/L蛋白胨15～20g/L玉米淀粉10～20g/L?NaCl?5～10g/L

7.如權利要求5所述的方法(2)種子培養基組成如下：

葡萄糖12～15g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母浸膏2g～5/L，NaCl?6～10g/L。

8.權利要求1-7所述菌種和篩選方法和抗真菌蛋白(AFP)的發酵生產用于啤酒大麥制麥的用途。