[發明專利]一種能對目標蛋白進行非色譜分離的融合標簽蛋白及其編碼基因和制備方法

無效

• 申請號: 201010562100.5
• 申請日: 2010-11-16
• 公開（公告）號: CN102127156A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發明（設計）人: 張光亞;黃凱宗;李夏蘭;林毅;陳國
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C07K19/00;C12N1/21;C12N15/12
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 張梧邨

技術領域

本發明涉及一種能對目標蛋白進行非色譜分離的融合標簽蛋白及其編碼基因和制備方法。

背景技術

近年來，生物技術尤其是基因工程的迅猛發展，表達蛋白已變得較容易。相對而言，純化卻是一個非常繁雜的工作。蛋白質分子大規模分離純化是當前生物工程中的關鍵技術問題，純化過程所需成本約占總成本的60％-70％。興起于20世紀末的融合標簽技術促進了重組蛋白純化技術的發展，其主要過程是利用重組DNA技術在靶蛋白編碼基因的3′端或5′端融合某種標簽的編碼基因，通過宿主表達重組蛋白質，該重組蛋白可通過其融合的標簽與包被在固相基質上的特異配基結合而得以純化。此方法已成為后基因組學時代純化重組蛋白常用手段。它無需了解蛋白質的生化特性或生理活性，就可通過帶標簽的重組融合蛋白選擇性地與層析基質上的配體結合，從而得以純化蛋白。采用保護蛋白質結構和功能完整性的溫和條件，已成功地通過一步親和層析從粗提物中純化出了多種重組蛋白，純度達90％以上。其中最為典型的代表就是聚組氨酸(以鎳離子為配基)，此法具有快速、高分辨率等諸多優點。

融合表達在最初的檢測和純化時會很方便，但若對目標蛋白進行生化及功能分析，需要避免親和標簽所帶來的潛在干擾，通常必需去掉外源融合標簽，尤其是具有治療和診斷用途的蛋白，往往必需去掉所有外源氨基酸。已建立了數種對融合蛋白進行位點特異性裂解的方法。早期的化學裂解法雖便宜、有效，但由于裂解位點特異性低和可能對目標蛋白產生不必要修飾，已被酶解法逐步取代。酶解法條件較溫和，且普遍用于此用途的?蛋白酶都具有高度特異性，它們均具有較長的底物識別序列，降低了蛋白質中其它無關部位發生斷裂的可能性。但酶解法成本高(這些酶價格一般都相當昂貴)、反應時間長(10多個小時)、更重要的是這些酶蛋白不可避免地混入目標蛋白中，造成新的污染，需在裂解后附加層析分離除去，使純化工藝復雜化。此外，與融合標簽結合的特異配基價格昂貴也限制了在大規模分離純化中的應用。因此，發展簡單易行、廉價、可靠的蛋白質純化方法對于大規模生產重組蛋白及高通量蛋白質組學研究具有重要意義。

發明內容

為了解決上述問題，本發明的目的在于提供了一種能對目標蛋白進行非色譜分離的融合標簽蛋白及其編碼基因和制備方法。本發明制備的融合標簽蛋白能快速與目標蛋白融合，經過條件的控制，可采用離心或過濾的方法分離重組蛋白，效果顯著；蛋白表達條件簡單，易于操作，生產成本低廉，因而適宜進行工業化生產。

為達到上述的目的，本發明采用如下技術方案：

一種能對目標蛋白進行非色譜分離的融合標簽蛋白，它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一種。(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCCNO.4185，大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，保藏日期：2010年9月17日。)

一種能對目標蛋白進行非色譜分離的融合標簽蛋白的編碼基因，它具有序列表2所示的核苷酸序列。(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號CGMCC?NO.4185，大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，保藏日期：2010年9月17日。)

一種能對目標蛋白進行非色譜分離的融合標簽蛋白的制備方法，采用序列表2所示核苷酸序列的編碼基因融合表達之后經高速離心進行分離制備該融合標簽蛋白。

所述的序列表2所示的編碼基因插入到經人工改造后的表達載體pET-22b(購于上海捷瑞生物工程有限公司)，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)或者BLR菌株中，用熱擊法轉化到大腸桿菌BL21(DE3)或者大腸桿菌BLR菌?株中(二者均為商業化菌株，可直接從上海超研生物科技有限公司、上海博亞生物科技有限公司購買)。BL21(DE3)基因型：F_omp?T?hsdSB(rB_mB_)dcm?gal(DE3)pLysS?Cam?r，特點：該菌株帶有質粒pLysS，具有氯霉素抗性。大腸桿菌BLR菌株為BL21(DE3)的衍生株，它是recA-，RecA是大腸桿菌中介導同源重組的重要蛋白之一。它的缺失，可以保證質粒的穩定。質粒中含有表達T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導的表達。