[發(fā)明專利]一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白及其編碼基因和制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010562100.5
• 申請(qǐng)日: 2010-11-16
• 公開（公告）號(hào): CN102127156A
• 公開（公告）日: 2011-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張光亞;黃凱宗;李夏蘭;林毅;陳國
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華僑大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/00
• 分類號(hào): C07K14/00;C07K19/00;C12N1/21;C12N15/12
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司 35205
• 代理人: 張梧邨

1.一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白，其特征在于：它具有序列表1所示的氨基酸序列或其融合蛋白、或其功能性片段、或其功能性片段衍生物中的一種；該氨基酸序列由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC?NO.4185，保藏日期：2010年9月17日。

2.一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的編碼基因，其特征在于：它具有序列表2所示的核苷酸序列；該核苷酸序列由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏號(hào)CGMCC?NO.4185，保藏日期：2010年9月17日。

3.一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，其特征在于：采用序列表2所示核苷酸序列的編碼基因融合表達(dá)之后經(jīng)高速離心進(jìn)行分離制備該融合標(biāo)簽蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，其特征在于：所述的序列表2所示的編碼基因插入到經(jīng)人工改造后的表達(dá)載體pET-22b，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)或者BLR菌株中，經(jīng)過質(zhì)粒酶切分析、PCR鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)使編碼基因獲得融合高效表達(dá)，細(xì)胞破碎后，利用高速離心對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，其特征在于：所述的表達(dá)載體pET-22b的人工改造包括如下步驟：1)人工合成序列表3的基因片段；2)用上述基因片段替換初始pET-22b(+)中NdeI與EcoRI酶切位點(diǎn)之間的序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，其特征在于所述的高效表達(dá)為低溫誘導(dǎo)表達(dá)，包括如下步驟：1)將甘油菌按1∶100的體積比接入到含100mg/L氨芐青霉素的Luria-Bertani培養(yǎng)基液體中培養(yǎng)，4℃保存，離心收集細(xì)胞；2)將細(xì)胞重懸浮于2ml含100mg/L氨芐青霉素2ml的LB液體中，再培養(yǎng)，以此接種；按1∶100的接種量接種于TB培養(yǎng)基中，置于37℃搖床，以200r/min的速度，培養(yǎng)4-5小時(shí)；加入終濃度為1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7小時(shí)；之后，4℃下以4000r/min的速度，離心15分鐘，按照1L菌液40mlPBS緩沖液重懸菌體。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，其特征在于所述的細(xì)胞破碎采用超聲波法，包括如下步驟：1)取出加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)7小時(shí)后的錐形瓶，冰浴，使細(xì)胞停止生長，將菌液分裝于100ml離心管中，使處于對(duì)稱位置的離心管質(zhì)量相等，離心，離心條件轉(zhuǎn)速PBS緩沖溶液∶菌液4000r/min，時(shí)間15min；2)離心機(jī)停止后，取離心管，棄上清，按PBS緩沖溶液∶菌液＝1∶25的體積比加入PBS緩沖溶液洗滌菌體，在旋渦混合器上充分振蕩，直至將離心管底的菌體沖洗干凈，收集；3)用超聲波破碎機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，條件為超2s，停2s，80個(gè)循環(huán)，之后收集細(xì)胞破碎液。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行非色譜分離的融合標(biāo)簽蛋白的制備方法，其特征在于所述的純化采用高速離心法純化蛋白，包括如下步驟：1)加入終濃度為0.5％W/V聚乙烯亞胺，振蕩，使其充分混勻，去除核酸；2)將蛋白質(zhì)溶液分裝于10ml的離心管，冰浴15min，離心，其條件為4℃，14000r/min，離心時(shí)間15min；3)取出離心管，將上清液移到干凈的離心管，棄沉淀，按NaCl溶液∶上清液＝1∶2的體積比加入NaCl溶液，45℃恒溫水浴15min，離心，離心條件為38℃，13500r/min，時(shí)間為5min；4)取出離心管，迅速棄上清，每管加2mlPBS緩沖溶液，沿管壁緩慢滴加，使壁上的蛋白質(zhì)充分溶解，冰浴15min后離心，離心條件為4℃，14000r/min，時(shí)間為5min；5)重復(fù)步驟3)和4)一次。最終棄沉淀，收集上清，保存在-20℃冰箱中；6)透析后冷凍干燥。