[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010560948.4
• 申請日: 2010-11-25
• 公開（公告）號: CN102061309A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李紹清;田裴秀子;朱英國
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水稻活體轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法，適用于秈稻和粳稻，以及各種可以利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的的質(zhì)粒。

背景技術(shù)

1983年，美國華盛頓大學(xué)植物學(xué)家Zambryski等用切去成瘤基因的根瘤農(nóng)桿菌(At)首次實(shí)現(xiàn)了抗卡那霉素基因(npt?II)在煙草上的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，使轉(zhuǎn)基因的煙草具有抗卡那霉素的特性(王琴芳等，2000)。這一開創(chuàng)性的研究拉開了全球性的轉(zhuǎn)基因植物研究、開發(fā)和利用的新的農(nóng)業(yè)技術(shù)革命。如：美國孟山都公司把編碼蘇云金桿菌的毒素蛋白基因引入到棉花、煙草等植物上，最先培育出抗蟲棉和抗蟲煙草新品種。越來越多的事例證明，轉(zhuǎn)基因植物不僅可以提高農(nóng)作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)；也可用于生產(chǎn)有益于人們身體健康的食品、藥品和促進(jìn)環(huán)境保護(hù)的化工產(chǎn)品的開發(fā)。因此，開拓轉(zhuǎn)基因植物研究具有廣闊的應(yīng)用前景。自1996年第一個轉(zhuǎn)基因作物品種商業(yè)化種植以來，全世界轉(zhuǎn)基因作物的種植面積逐年增加，2000年以后年均增長率達(dá)到15％，現(xiàn)已有轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜已進(jìn)入大規(guī)模商業(yè)化應(yīng)用階段。至2005年，全球轉(zhuǎn)基因作物面積達(dá)9000萬公頃。以轉(zhuǎn)基因性狀而言，面積最大的是抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物，其次是抗蟲轉(zhuǎn)基因作物。如我國抗蟲棉的種植面積占棉花總面積的66％以上(黃軍英，2007)。現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因水稻、番茄、馬鈴薯、煙草等重要農(nóng)作物也在逐步進(jìn)入商業(yè)化階段。

水稻是世界上最重要的糧食作物，因此，水稻的遺傳改良一直備受人們關(guān)注，它對保障世界糧食安全和提高人們生活水平意義重大。但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前水稻的轉(zhuǎn)基因方法主要還是通過愈傷組織，不僅耗時長、效率低，而且受基因型的限制(秦代錦等，2008)。尤其秈稻由于組織培養(yǎng)的分化再生頻率低，一直是限制水稻基因工程規(guī)模化應(yīng)用的瓶頸(寧約瑟等，2007)。因此，自從轉(zhuǎn)基因技術(shù)誕生以來，人們一直在探索適合水稻的轉(zhuǎn)基因方法，改良水稻品質(zhì)和產(chǎn)量。2000年《科學(xué)》雜志報(bào)道德國和瑞士的科研人員合作將含有3種外源基因(兩個來自水仙花，一個來自細(xì)菌)轉(zhuǎn)化水稻品種獲得了金稻品種，能夠產(chǎn)生維生素A原。2005年，英國的科學(xué)家通過進(jìn)一步努力，將金稻進(jìn)一步改進(jìn)，獲得了可以商品化的金稻品種，其Vitamin?A的生產(chǎn)能力達(dá)到35mg/g以上，這對改善非洲和亞洲地區(qū)青少年Vitamin?A缺乏起到重要的推動作用(Tang，2009)。此外，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)合作成功地獲得了轉(zhuǎn)Bt基因雜交水稻，對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟的毒殺效果達(dá)到95％。但這些水稻遺傳工程的進(jìn)展并沒有帶來轉(zhuǎn)基因方法學(xué)上的突破，因此，水稻轉(zhuǎn)基因的研究仍然是水稻遺傳工程的障礙之一。為了探討如何利用外源有利基因改良水稻品種，多年來，人們一直在進(jìn)行各種嘗試，探討、研究水稻的高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。

經(jīng)過多年的試驗(yàn)和探索，我們以特定的外源表達(dá)載體作為研究對象，采用農(nóng)桿菌溶液注射浸泡減數(shù)分裂和四分體時期的幼穗，感染幼嫩的生殖組織，將外源基因整合到受體植株的基因組中。為了便于規(guī)模化應(yīng)用，我們采用攜帶有GUS和Bar基因的雙標(biāo)記表達(dá)載體。在經(jīng)過簡單的除草劑噴施篩選即可獲得株陽性水稻，并可通過進(jìn)一步的PCR分子定性檢測陽性株。

在我們的研究中，曾注射過上百個稻穗，轉(zhuǎn)化效率達(dá)0.33-1.59％。并經(jīng)PCR和GUS染色雙重檢測證明外源質(zhì)粒整合到受體水稻的基因組中并正常表達(dá)。更為重要的是，本研究采用的是秈稻品種9311作為受體，充分證明了該方法在秈稻中應(yīng)用的可行性。因此，它的成功將使秈稻的轉(zhuǎn)化不再成為水稻遺傳工程的障礙，為我國廣泛栽培的秈稻的生物技術(shù)的應(yīng)用開創(chuàng)了光明的前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于在于提供了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法，方法易行，操作簡便，該發(fā)明涉及生產(chǎn)上種植的秈稻和粳稻品種，都有較好轉(zhuǎn)化效率。該方法涉及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌濃度范圍的選擇，以農(nóng)桿菌溶液的OD₆₀₀值在0.3～0.6時轉(zhuǎn)化效果最優(yōu)。可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化水稻的外源質(zhì)粒，植物表達(dá)質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)可以有效地將外源基因整合在水稻基因組中。轉(zhuǎn)化水稻發(fā)育時期的選擇，不論秈稻和粳稻，在水稻小孢子減數(shù)分裂期和四分體時期是最有效的轉(zhuǎn)化時期。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及以下技術(shù)措施：

一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻活體轉(zhuǎn)基因方法，其步驟是：

1、幼穗轉(zhuǎn)化處理：

利用分光光度計(jì)測定農(nóng)桿菌濃度后，將農(nóng)桿菌菌株EH105A(購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)溶液用液體LB培養(yǎng)基稀釋至OD₆₀₀值0.3～0.6，然后按1ml分裝在1.5ml離心管中備用。