[發明專利]一種農桿菌介導的水稻活體轉基因方法

無效

• 申請號: 201010560948.4
• 申請日: 2010-11-25
• 公開（公告）號: CN102061309A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發明（設計）人: 李紹清;田裴秀子;朱英國
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種農桿菌介導的水稻活體轉基因方法，其步驟是：

A、幼穗轉化處理：利用分光光度計測定農桿菌濃度后，將農桿菌溶液用液體LB培養基稀釋至OD600值0.3～0.6，然后按1ml分裝在1.5ml離心管中備用；

注射處理：選擇減數分裂至四分體時期的幼穗，掛上標簽，做好記號，注射時，首先注射器吸取1ml農桿菌，將注射器斜著從中上部插入，推動注射器，將農桿菌液注進穗腔，注射后，套袋、掛牌，并在標簽牌注明品種、日期、濃度和發育時期，注射處理40～50天后，收獲成熟稻穗；

B、轉基因陽性苗的除草劑篩選：轉基因載體pCAMBIA3301-ubi攜帶抗除草劑草胺磷基因，利用除草劑草胺磷篩選轉基因陽性水稻，篩選時，將pCAMBIA3301-ubi轉化處理所獲得的種子常規方法催芽后，播種于營養缽中，以非轉基因9311為對照，苗期2葉1心時噴施濃度為50mg/l的Basta，連續噴施兩天，每天一次，四天后，絕大部分植株變黃，一周后，除了陽性轉基因幼苗仍然綠色外，其他的假陽性苗子全部枯死，將正常的抗性植株移栽至新的培養盆中，用于后續的分子檢測；

C、轉基因陽性株的檢測PCR鑒定：為了進一步驗證抗除草劑篩選出的陽性植株，提取了其葉片的總DNA進行PCR檢測，所設計的ubi引物ubi-F:?TGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCC；ubi-R:?TTCTATCGCGGCTTAACGTAATTCA擴增出的目的片段大小為200bp，轉基因植株中擴增出一條特異性、與目的帶大小一致的200bp條帶，篩選出的轉基因水稻為陽性植株；

D、轉基因陽性株的GUS檢測：為了更進一步鑒定外源基因在受體植株中正常表達，采用組織化學染色法分析了GUS基因在轉基因植株中的表達，取對照9311和轉基因陽性植株的新鮮葉片直接浸泡在0.5?mg/ml的X-Gluc：5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷溶液中處理3h，觀察轉基因植株中GUS基因在水稻中的表達，染色結果顯示，GUS基因在轉基因植株的葉片中表達，葉片被染色成深藍色；對照9311的葉片為淺色，和陽性水稻形成鮮明的對照，轉基因水稻中外源基因正常表達，進一步證明為陽性。