[發(fā)明專利]尿液樣本細(xì)菌性病原體檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010558217.6
• 申請(qǐng)日: 2010-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN101974646A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任緒義;呂江峰;嚴(yán)一紅;虞閏六
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬臨床微生物鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及尿液樣本細(xì)菌性病原體檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

世界范圍內(nèi)尿路感染是最常見的細(xì)菌性感染疾病之一，往往導(dǎo)致嚴(yán)重的尿膿毒癥甚至病人死亡，尤其是免疫缺陷病人。研究表明，大約50％的婦女一生中至少發(fā)生過(guò)一次尿路感染。同時(shí)，每年大約有10％的兒童發(fā)生尿路感染而導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)熱性疾病伴隨排尿困難及腹痛等癥狀。

目前，尿液半定量是臨床上診斷尿路感染病原菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是該法存在諸多缺陷。首先，從拿到尿液標(biāo)本到得到病原菌鑒定結(jié)果需要48小時(shí)，而在這期間醫(yī)生往往在沒有確定病原菌的情況下采用經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療，這會(huì)導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生以及細(xì)菌耐藥性。其次，尿培養(yǎng)需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)人員才能進(jìn)行。

其他一些快速檢測(cè)尿液樣本中病原菌的方法包括尿液鏡檢、尿素試驗(yàn)以及PCR等。尿液鏡檢是一種簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)尿液病原菌的方法，但其缺陷在于只能檢測(cè)尿液中有無(wú)病原菌而無(wú)法鑒定具體病原菌種屬，并且其低敏感度也一定程度上限制了在臨床上的廣泛應(yīng)用。尿素試驗(yàn)主要用于檢測(cè)尿液中最為常見的腸桿菌科細(xì)菌，對(duì)單胞菌屬及腸球菌屬等不產(chǎn)生尿素的菌群無(wú)法檢測(cè)。PCR結(jié)合DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被證明是檢測(cè)鑒定細(xì)菌及其他微生物的有效手段。以16S?rRNA基因?yàn)闇y(cè)序片段進(jìn)行細(xì)菌種屬鑒定具有諸多優(yōu)勢(shì)。16S?rRNA以多拷貝的形式存在于所有細(xì)菌中，其結(jié)構(gòu)由8個(gè)保守區(qū)域及9個(gè)可變區(qū)組成。因此，在16S?rRNA保守區(qū)設(shè)計(jì)引物理論上能擴(kuò)增出絕大多數(shù)細(xì)菌的DNA片段，然后通過(guò)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物中的可變區(qū)即可區(qū)分不同的細(xì)菌種屬。

Pyrosequencing(焦磷酸測(cè)序)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便。Pyrosequencing技術(shù)是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，在每一輪測(cè)序反應(yīng)中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對(duì)，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(PPi)。PPi可最終轉(zhuǎn)化為可見光信號(hào)，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個(gè)峰值。每個(gè)峰值的高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續(xù)DNA鏈的合成。該技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，因此廣受研究者青睞，并在很多方面已應(yīng)用于臨床微生物的分型鑒定及耐藥檢測(cè)。

Monstein等用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)幽門螺桿菌16S?rRNA基因16S?rDNA的V1和V3區(qū)序列，將胃鏡活檢標(biāo)本中得到的23個(gè)幽門螺桿菌標(biāo)本依據(jù)其V1區(qū)的核苷酸序列差異，鑒定出8種不同的等位基因類型，除11個(gè)樣本與幽門螺桿菌26?695株序列一致、1個(gè)樣本與199株的序列一致外，根據(jù)V1區(qū)的改變表現(xiàn)為有1個(gè)或2個(gè)核苷酸的突變或單個(gè)核苷酸的插入而分為4個(gè)等位基因類型。另有2個(gè)標(biāo)本的V3區(qū)出現(xiàn)C至T轉(zhuǎn)換，證明此技術(shù)可滿足對(duì)臨床病原菌標(biāo)本的快速鑒定和分型。Unner?stad等利用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)106株不同血清型的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行了分型，根據(jù)inIB基因第1575位和1578位核苷酸的變化，將血清型1/2a和1/2c分為一組，1/2b和3b分為一組，而血清型4b又可分為2個(gè)組。該技術(shù)還被應(yīng)用于百日咳桿菌(Bordetella?pert?ussis)與副百日咳桿菌(Parapert?ussis)等細(xì)菌的快速鑒定及分型。Martin等運(yùn)用此技術(shù)對(duì)百日咳桿菌毒力相關(guān)ptxS1基因進(jìn)行了分型鑒定，并與定量PCR作了方法學(xué)的比較，結(jié)果顯示兩種方法具有很好的一致性，焦磷酸測(cè)序技術(shù)適合百日咳桿菌的大規(guī)模篩選。此外，Alistair等用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腸球菌的23s?rRNA上的抗利奈唑胺位點(diǎn)，并與PCR-RFLP方法比較，結(jié)果顯示了100％的一致性。Marjo等用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)鳥分支桿菌，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，空腸彎曲桿菌，流感(嗜血)桿菌等多種病原體的23S?rRNA基因2058位多態(tài)性，以獲得病原體的大環(huán)內(nèi)脂抗藥性信息。趙錦榮等建立了基于焦磷酸測(cè)序技術(shù)的高通量檢測(cè)耐利福平結(jié)核分支桿菌的方法，并用傳統(tǒng)的測(cè)序方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示了100％一致性，他們認(rèn)為這種方法具有自動(dòng)化程度高和結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，相比傳統(tǒng)的測(cè)序，具有更快速，簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適用于耐利福平結(jié)核分支桿菌的快速高通量的檢測(cè)。