[發明專利]尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010558217.6
• 申請日: 2010-11-25
• 公開（公告）號: CN101974646A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 任緒義;呂江峰;嚴一紅;虞閏六
• 申請（專利權）人: 杭州迪安醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬臨床微生物鑒定技術領域，具體涉及尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

世界范圍內尿路感染是最常見的細菌性感染疾病之一，往往導致嚴重的尿膿毒癥甚至病人死亡，尤其是免疫缺陷病人。研究表明，大約50％的婦女一生中至少發生過一次尿路感染。同時，每年大約有10％的兒童發生尿路感染而導致嚴重的發熱性疾病伴隨排尿困難及腹痛等癥狀。

目前，尿液半定量是臨床上診斷尿路感染病原菌的標準方法，但是該法存在諸多缺陷。首先，從拿到尿液標本到得到病原菌鑒定結果需要48小時，而在這期間醫生往往在沒有確定病原菌的情況下采用經驗性抗生素治療，這會導致副作用的產生以及細菌耐藥性。其次，尿培養需要經驗豐富的專業人員才能進行。

其他一些快速檢測尿液樣本中病原菌的方法包括尿液鏡檢、尿素試驗以及PCR等。尿液鏡檢是一種簡單、快速的檢測尿液病原菌的方法，但其缺陷在于只能檢測尿液中有無病原菌而無法鑒定具體病原菌種屬，并且其低敏感度也一定程度上限制了在臨床上的廣泛應用。尿素試驗主要用于檢測尿液中最為常見的腸桿菌科細菌，對單胞菌屬及腸球菌屬等不產生尿素的菌群無法檢測。PCR結合DNA測序技術已經被證明是檢測鑒定細菌及其他微生物的有效手段。以16S?rRNA基因為測序片段進行細菌種屬鑒定具有諸多優勢。16S?rRNA以多拷貝的形式存在于所有細菌中，其結構由8個保守區域及9個可變區組成。因此，在16S?rRNA保守區設計引物理論上能擴增出絕大多數細菌的DNA片段，然后通過測定擴增產物中的可變區即可區分不同的細菌種屬。

Pyrosequencing(焦磷酸測序)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，操作極為簡便。Pyrosequencing技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可最終轉化為可見光信號，并由PyrogramTM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。然后加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。該技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便于構建標準化操作流程，因此廣受研究者青睞，并在很多方面已應用于臨床微生物的分型鑒定及耐藥檢測。

Monstein等用焦磷酸測序技術檢測幽門螺桿菌16S?rRNA基因16S?rDNA的V1和V3區序列，將胃鏡活檢標本中得到的23個幽門螺桿菌標本依據其V1區的核苷酸序列差異，鑒定出8種不同的等位基因類型，除11個樣本與幽門螺桿菌26?695株序列一致、1個樣本與199株的序列一致外，根據V1區的改變表現為有1個或2個核苷酸的突變或單個核苷酸的插入而分為4個等位基因類型。另有2個標本的V3區出現C至T轉換，證明此技術可滿足對臨床病原菌標本的快速鑒定和分型。Unner?stad等利用焦磷酸測序技術對106株不同血清型的單核細胞增生李斯特氏菌進行了分型，根據inIB基因第1575位和1578位核苷酸的變化，將血清型1/2a和1/2c分為一組，1/2b和3b分為一組，而血清型4b又可分為2個組。該技術還被應用于百日咳桿菌(Bordetella?pert?ussis)與副百日咳桿菌(Parapert?ussis)等細菌的快速鑒定及分型。Martin等運用此技術對百日咳桿菌毒力相關ptxS1基因進行了分型鑒定，并與定量PCR作了方法學的比較，結果顯示兩種方法具有很好的一致性，焦磷酸測序技術適合百日咳桿菌的大規模篩選。此外，Alistair等用焦磷酸測序技術檢測腸球菌的23s?rRNA上的抗利奈唑胺位點，并與PCR-RFLP方法比較，結果顯示了100％的一致性。Marjo等用焦磷酸測序技術檢測鳥分支桿菌，肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，空腸彎曲桿菌，流感(嗜血)桿菌等多種病原體的23S?rRNA基因2058位多態性，以獲得病原體的大環內脂抗藥性信息。趙錦榮等建立了基于焦磷酸測序技術的高通量檢測耐利福平結核分支桿菌的方法，并用傳統的測序方法進行驗證，結果顯示了100％一致性，他們認為這種方法具有自動化程度高和結果準確等特點，相比傳統的測序，具有更快速，簡便等特點，適用于耐利福平結核分支桿菌的快速高通量的檢測。