[發明專利]尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010558217.6
• 申請日: 2010-11-25
• 公開（公告）號: CN101974646A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 任緒義;呂江峰;嚴一紅;虞閏六
• 申請（專利權）人: 杭州迪安醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒，其特征在于它包括：

(1)擴增細菌16S?rRNA的V1可變區的通用引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示引物對；

(2)測序引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

(3)親和素標記的磁珠；

其中，SEQ?ID?NO：1在其5’端標記生物素；

在一次檢測中共同使用。

2.根據權利要求1所述的尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒，其特征在于它包括如下試劑：

(1)DNA提取試劑：50mg/mL?Chelex?100緩沖液，20mg/mL蛋白酶K；

(2)反應液：PCR?Buffer，通用引物SEQ?ID?NO：1～2，2mM?MgCl₂，0.2mM?dNTPs，2U/μLTaq?DNA聚合酶；

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM?pH?7.6Tris-Acetate溶液，結合緩沖液，退火緩沖液；

(4)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。

3.一種尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒，其特征在于它包括：

(1)擴增細菌16S?rRNA的V1可變區的通用引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示引物對；

(4)測序引物：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示；

(5)親和素標記的磁珠；

其中，SEQ?IDNO：3在其5’端標記生物素；

在一次檢測中共同使用。

4.根據權利要求3所述的尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒，其特征在于它包括如下試劑：

(1)DNA提取試劑：50mg/mL?Chelex?100緩沖液，20mg/mL蛋白酶K；

(2)反應液：PCR?Buffer，通用引物SEQ?ID?NO：3～4，2mM?MgCl₂，0.2mM?dNTPs，2U/μL?Taq?DNA聚合酶；

(3)單鏈純化試劑：75％(v/v)乙醇溶液，0.2MNaOH，10mM?pH?7.6Tris-Acetate溶液，結合緩沖液，退火緩沖液；

(4)測序試劑：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒光素和dNTP。

5.一種尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于它包括如下步驟：

(1)提取尿液中細菌DNA；

(2)以步驟(1)所得DNA為模板，利用通用引物進行細菌16S?rRNA的V1可變區的PCR擴增；

(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；

(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產物進行焦磷酸測序；

(5)測序結果與數據庫比對判斷細菌種屬。

6.根據權利要求5所述的尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR擴增體系為：10×PCR?buffer?5μL，SEQ?ID?NO：10.3μL，SEQ?ID?NO：20.3μL，Template?DNA?3μl，0.2mM?dNTPs，2mM?MgCl₂。Taq?DNA聚合酶2U，加無菌水至50μL；PCR擴增條件為：94℃3min；28個循環，94℃25s，42℃30s，72℃20s；72℃3min。

7.根據權利要求5所述的尿液樣本細菌性病原體檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于步驟(2)中所述的PCR擴增體系為：10×PCR?buffer?5μL，SEQ?ID?NO：30.3μL，SEQ?ID?NO：40.3μL，Template?DNA?3μl，0.2mM?dNTPs，2mM?MgCl₂，Taq?DNA聚合酶2U，加無菌水至50μL；PCR擴增條件為：94℃3min；28個循環，94℃25s，42℃30s，72℃20s；72℃3min。