[發(fā)明專利]一種抗菌蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010558015.1
• 申請日: 2010-11-24
• 公開（公告）號: CN102079778A
• 公開（公告）日: 2011-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸婕
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/12;C12N15/63;C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心 42201
• 代理人: 夏惠忠

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及抗菌蛋白，具體涉及抗菌蛋白的氨基酸序列及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗生素人類抵御細(xì)菌感染類疾病的主要武器，在醫(yī)學(xué)發(fā)展史上發(fā)揮著重要的作用。但隨著抗生素長期使用及濫用，導(dǎo)致許多細(xì)菌耐藥性增加，如臨床上耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、銅綠假單孢菌等。最近出現(xiàn)的“超級細(xì)菌”能夠耐受幾乎所有的抗生素，已有多起致死病例，引起了世界性恐慌。尋找無細(xì)菌耐藥性、能夠替代抗生素的藥物迫在眉睫。

抗菌蛋白是生物體經(jīng)免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的小蛋白，有抑殺細(xì)菌、真菌、原蟲和腫瘤細(xì)胞等多種功能。由于抗菌蛋白主要通過破壞細(xì)胞膜機制殺死細(xì)胞，不易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株，容易被降解，不在微生物體內(nèi)富集，因此被認(rèn)為是能夠替代抗生素的首選藥物。已有報道來自青蛙皮的抗菌蛋白能夠?qū)埂俺壖?xì)菌”，但對人體細(xì)胞也有潛在毒性。尋找高效、無藥物抗性、對人體細(xì)胞無毒害的新型抗菌蛋白是目前研究的熱點。

天然抗菌蛋白的含量很低，提取步驟復(fù)雜；化學(xué)合成法制備蛋白的成本很高，遠(yuǎn)不能滿足應(yīng)用需要；抗菌蛋白對細(xì)菌有殺傷作用，不宜在原核系統(tǒng)中直接表達(dá)。畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成功的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，具有許多優(yōu)點：(1)利用受甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶(AOXI)啟動子，可嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá)，在胞外和胞內(nèi)都可表達(dá)外源基因；(2)畢赤酵母生長速度快，培養(yǎng)條件簡單，適合高密度發(fā)酵，有利于提高目的蛋白產(chǎn)量；(3)畢赤酵母作為真核細(xì)胞生物，可進(jìn)行翻譯后的蛋白加工，使其表達(dá)的蛋白得到正確的折疊和修飾，避免活性損失。國內(nèi)外已有抗菌蛋白在畢赤酵母中成功分泌表達(dá)的報道。只要設(shè)計出適合酵母表達(dá)的抗菌蛋白基因序列，就能通過畢赤酵母大規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白，降低生產(chǎn)成本，為抗菌藥物的生產(chǎn)提供大量原料。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的任務(wù)是提供一種抗菌蛋白，同時提供這種抗菌蛋白的制備方法和應(yīng)用。

實現(xiàn)本發(fā)明的具體方案是：

本發(fā)明提供的這種抗菌蛋白具有序列表中序列1或序列15所示的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因，該基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列或依照遺傳密碼簡并性而衍生于序列2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明抗菌蛋白的重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體含有編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因。進(jìn)一步說，該重組表達(dá)載體是在表達(dá)載體的多克隆位點中插入了編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因，在所插入的編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因的5’端加入了酶切位點和甲硫氨酸密碼子，在所插入的編碼本發(fā)明抗菌蛋白的基因的3’端加入了終止密碼子和酶切位點。制備該重組表達(dá)載體的表達(dá)載體可以是pPIC9K質(zhì)粒。

表達(dá)本發(fā)明抗菌蛋白的pPIC9K重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)DNA聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)：反應(yīng)條件為：序列表中序列3所示的引物P1和序列表中序列4所示的引物R1(10μmol/L)各5μL，2×pfu?PCR?MasterMix?10μL，94℃變性3min，72℃延伸10min，得到DNA產(chǎn)物；

(2)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴增DNA片段：PCR反應(yīng)條件為：上述步驟(1)中的DNA產(chǎn)物1μL，序列表中序列5所示的引物P2(10μmol/L)和序列表中序列6所示的引物R2(10μmol/L)各1μL，2×pfu?PCR?MasterMix?10μL，超純水7μL，94℃變性3min后，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循環(huán)，再72℃延伸5min，得到擴增的DNA產(chǎn)物；

(3)用上述步驟(2)的DNA產(chǎn)物1μL，序列表中序列7所示的引物P3(10μmol/L)和序列表中序列8所示的引物R3(10μmol/L)各1μL，PCR條件與上述步驟(2)相同，得到進(jìn)一步擴增的DNA產(chǎn)物；

(4)用上述步驟(3)中的DNA產(chǎn)物1μL，序列表中序列9所示的引物P4(10μmol/L)和序列表中序列10所示的引物R4(10μmol/L)各1μL，PCR條件與上述步驟(2)相同，合成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本發(fā)明抗菌蛋白基因的DNA產(chǎn)物；

(5)上述步驟(4)中的DNA產(chǎn)物用EcoRI酶切，pPIC9K質(zhì)粒用EcoRI酶切并用CIAP堿性磷酸酶去磷酸化，電泳并回收酶切后的DNA產(chǎn)物和pPIC9K，經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接4h，得到的混合溶液體系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質(zhì)粒和反向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質(zhì)粒；