[發(fā)明專利]一種抗菌蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010558015.1
• 申請日: 2010-11-24
• 公開（公告）號: CN102079778A
• 公開（公告）日: 2011-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陸婕
• 申請（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號: C07K14/00
• 分類號: C07K14/00;C12N15/12;C12N15/63;C12N15/81;C12P21/02;C12R1/84
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心 42201
• 代理人: 夏惠忠

1.一種抗菌蛋白，具有序列表中序列1或序列15所示的氨基酸序列。

2.編碼權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白的基因，具有序列表中序列2所示的核苷酸序列或依照遺傳密碼簡并性而衍生于序列2所示的核苷酸序列。

3.一種重組表達載體，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的編碼權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白的基因。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達載體，其特征在于，它是在表達載體的多克隆位點中插入了權(quán)利要求2所述的基因，在所插入的權(quán)利要求2所述基因的5’端加入了酶切位點和甲硫氨酸密碼子，在所插入的權(quán)利要求2所述基因的3’端加入了終止密碼子和酶切位點。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述的表達載體是pPIC9K質(zhì)粒。

6.表達權(quán)利要求1所述抗菌蛋白的pPIC9K重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)DNA聚合酶進行延伸反應(yīng)：反應(yīng)條件為：序列表中序列3所示的引物P1和序列表中序列4所示的引物R1(10μmol/L)各5μL，2×pfu?PCR?MasterMix?10μL，94℃變性3min，72℃延伸10min，得到DNA產(chǎn)物；

(2)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴增DNA片段：PCR反應(yīng)條件為：上述步驟(1)中的DNA產(chǎn)物1μL，序列表中序列5所示的引物P2(10μmol/L)和序列表中序列6所示的引物R2(10μmol/L)各1μL，2×pfu?PCR?MasterMix?10μL，超純水7μL，94℃變性3min后，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循環(huán)，再72℃延伸5min，得到擴增的DNA產(chǎn)物；

(3)用上述步驟(2)的DNA產(chǎn)物1μL，序列表中序列7所示的引物P3(10μmol/L)和序列表中序列8所示的引物R3(10μmol/L)各1μL，PCR條件與上述步驟(2)相同，得到進一步擴增的DNA產(chǎn)物；

(4)用上述步驟(3)中的DNA產(chǎn)物1μL，序列表中序列9所示的引物P4(10μmol/L)和序列表中序列10所示的引物R4(10μmol/L)各1μL，PCR條件與上述步驟(2)相同，合成得到具有序列表中序列11所示序列的含有本發(fā)明抗菌蛋白基因的DNA產(chǎn)物；

(5)上述步驟(4)中的DNA產(chǎn)物用EcoRI酶切，pPIC9K質(zhì)粒用EcoRI酶切并用CIAP堿性磷酸酶去磷酸化，電泳并回收酶切后的DNA產(chǎn)物和pPIC9K，經(jīng)T4DNA連接酶16℃連接4h，得到的混合溶液體系中，含有正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質(zhì)粒和反向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質(zhì)粒；

(6)將上述步驟(5)中含有混合重組質(zhì)粒的溶液體系轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10菌株，在含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基上挑選單菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒；

(7)用序列表中序列12所示的引物α-Factor和序列表中序列10所示的引物R4，利用PCR方法篩選正向插入抗菌蛋白基因的pPIC9K重組質(zhì)粒，PCR反應(yīng)條件是：以1μL上述步驟(6)中的質(zhì)粒作為模板，α-Factor和R4(10μmol/L)引物各1μL，2×PCRMasterMix10μL，超純水7μL，94℃變性3min，按94℃30sec，55℃30sec，72℃1min共30次循環(huán)，再72℃延伸5min；經(jīng)電泳檢測，將能擴增出約370bp片段的質(zhì)粒進一步進行EcoRI酶切鑒定；酶切后的質(zhì)粒經(jīng)電泳檢測，將得到約290bp酶切片段的質(zhì)粒進行DNA序列測定，在EcoRI酶切位點上正向插入了序列表中序列2的質(zhì)粒，即為表達本發(fā)明抗菌蛋白的pPIC9K重組質(zhì)粒。

7.一種制備權(quán)利要求1所述的抗菌蛋白的方法，其特征在于：用SalI酶切以權(quán)利要求6所述方法構(gòu)建的pPIC9K重組質(zhì)粒，電泳回收線性化的pPIC9K重組質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)化法將回收的線性化的pPIC9K重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，將轉(zhuǎn)入了pPIC9K重組質(zhì)粒的畢赤酵母菌株接種到適合的培養(yǎng)基，在適合的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)抗菌蛋白基因表達，離心收集培養(yǎng)基上清液，經(jīng)純化得到本發(fā)明抗菌蛋白。