[發(fā)明專利]相思子毒素A鏈突變體的構(gòu)建及作為候選疫苗抗原

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010552967.2
• 申請日: 2010-11-19
• 公開（公告）號: CN102060920A
• 公開（公告）日: 2011-05-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王景林;韓艷輝;高姍;康琳
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/63;A61K38/16;A61P39/02
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種相思子毒素A鏈突變體的構(gòu)建及作為候選疫苗抗原，尤其涉及一種與相思子毒素疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展和生物毒素的開發(fā)利用，毒素在大規(guī)模殺傷性武器中的重要性已凸現(xiàn)出來，生物毒素及其生物恐怖的威脅與日俱增。相思子毒素是由A、B鏈組成，A鏈為效應(yīng)鏈，具有RNA?N-糖苷酶活性，B鏈為結(jié)合鏈，介導(dǎo)A鏈進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮毒性作用。不同產(chǎn)地的相思子含有在一級結(jié)構(gòu)上稍有差異的相思子毒素，表現(xiàn)為其毒性大小有差異，文獻(xiàn)報道的相思子毒素小鼠腹腔LD₅₀介于4-20μg/kg之間。生產(chǎn)原料相思籽來源廣泛，容易獲得，在許多公開的專業(yè)刊物和互聯(lián)網(wǎng)上又可輕易得到如何提取制備相思子毒素的詳細(xì)資料，所以，相思子毒素的恐怖威脅不容忽視。針對相思子毒素中毒，目前尚無預(yù)防疫苗、特異性抗毒素和解毒藥。通過分析現(xiàn)有的研究進(jìn)展和成果，美軍的生防專家認(rèn)為，疫苗研究是對抗其中毒的有效預(yù)防手段。因此，開展相思子毒素疫苗的研究，具有十分重要的軍事和社會意義。

我國學(xué)者對相思子毒素生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學(xué)防護(hù)等研究領(lǐng)域剛剛起步，針對相思子毒素的恐怖襲擊尚無配套診斷試劑和有效免疫治療及防護(hù)手段，因此迫切需要建立和發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權(quán)的檢測和防護(hù)用品。為了防止敵對勢力和恐怖組織使用相思子毒素等生物戰(zhàn)劑的襲擊，應(yīng)盡快建立和完善相思子毒素等生物戰(zhàn)劑的偵檢和醫(yī)學(xué)防護(hù)系統(tǒng)，保證及時采取應(yīng)急措施和對策，將生物恐怖襲擊造成的破壞降低到最低限度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種與相思子毒素疫苗相關(guān)蛋白及其編碼基因。

本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為mATA，是如下1)或2)中任一所述的蛋白質(zhì)：

1)由序列表中的序列2的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；

2)將序列表中的序列2氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述序列表中的序列2由251個氨基酸殘基組成。所述一個或數(shù)幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

mATA的編碼基因mATA也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，為如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且具有相同功能的DNA分子；

3)與1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的DNA分子。

上述序列表中的序列1由753個核苷酸組成，編碼區(qū)為序列1自5’末端第1-753位核苷酸。

含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述重組載體為將所述編碼基因插入載體pET-His的EcoRⅠ和NheⅠ識別位點間得到的重組載體。

所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。

擴(kuò)增所述編碼基因全長或任一片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述引物對的一條引物為序列3所示的DNA分子，另一條引物為序列4所示的DNA分子。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗，它的活性成分為如下1)-3)中任一一種：1)所述的蛋白質(zhì)；2)所述的重組載體；3)所述的重組菌。

所述蛋白質(zhì)在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述編碼基因在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述重組載體在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述重組菌在制備疫苗中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

所述疫苗為相思子毒素疫苗，具體為相思子毒素A鏈突變體疫苗。

本發(fā)明的實驗證明，經(jīng)過點突變獲得的突變體mATA，是通過重組表達(dá)得到的相思子毒素A鏈突變體蛋白，通過A鏈突變體免疫原的免疫途徑、劑量、次數(shù)、佐劑等多種不同免疫方案，分析相思子毒素A鏈突變體的免疫保護(hù)效果，結(jié)果為該突變體具有低毒性、無血管滲漏、有良好免疫原性等特點，可以作為候選疫苗抗原。

附圖說明

圖1為相思子毒素A鏈突變體純化圖

圖2為相思子毒素A鏈突變體的SDS-PAGE電泳圖

圖3為BCA法測定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4為相思子毒素A鏈突變體對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的殺傷作用曲線

圖5為相思子毒素A鏈突變體對骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0的殺傷作用曲線