[發明專利]人成纖維細胞生長因子21原核細胞中可溶性表達及制備

有效

• 申請號: 201010552880.5
• 申請日: 2010-11-15
• 公開（公告）號: CN102465129A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: 譚克海;陳海容;陳清;劉洪洪;范開
• 申請（專利權）人: 重慶富進生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/50;C12N15/63;C12N15/70;C12P21/02
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技術領域

本發明涉及DNA重組技術和藥物領域。更具體地，本發明涉及人成纖維細胞生長因子21(Fibroblast?Growth?Factor?21，FGF-21)的重組制備方法，編碼該蛋白的cDNA序列，含該cDNA序列的載體，含該載體的宿主細胞。本發明實現可溶性表達以及分離純化重組人FGF-21。

背景技術

成纖維細胞生長因子(Fibroblast?Growth?Factor，FGF)是一類由FGF基因家族成員編碼的結構相關的蛋白質，對內皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞等多種中胚層和神經外胚層來源的細胞有促進DNA合成和細胞分裂作用，主要由成纖維細胞、內皮細胞、骨細胞、多形細胞分泌，相對分子量一般在17～34kD。FGF家族成員的中心區域氨基酸具有30％-70％的同源性。FGF-21是最新被發現的一個FGFs成員，屬于FGF-19亞科。FGF-19亞科包括FGF-15、FGF-19、FGF-21和FGF-23，與其他FGF成員不同的是，他們以內分泌的形式對代謝起調控作用，且不具有與肝素結合的功能。FGF-21主要在成熟肝臟和胸腺中表達，最早由Nishimura等(Nishimura?T等，Biochim?Biophys?Acta，2000，1492：203-206)于2000年首次在小鼠胚胎中分離得到，其氨基酸序列與FGF-19和FGF-23的同源性分別為35％和24％。隨后在胰臟、脂肪組織和肌肉組織同樣發現了FGF-21的mRNA(Inagaki?T等，Cell?Metab，2007，5(6)：415-425)。人源FGF-21基因位于19號染色體，全長FGF-21蛋白由181個氨基酸的成熟FGF-21蛋白和位于N端的28個氨基酸的信號肽組成，其氨基酸序列與鼠源FGF-21約有75％相同。

近年來研究發現，FGF-21對血糖、血脂的代謝和體重控制起非常重要的作用。在這些作用過程中，其N末端和C末端發揮著不同的生物學功能，即N末端氨基酸參與與FGF受體的相互作用，C末端氨基酸參與與一種叫做β-Klotho的蛋白的相互作用(Micanovic?R等，J?CellPhys，2009，219(2)：227-234)。KharitonenkovA等在2005年首次報道了重組人FGF-21蛋白可以刺激分化的小鼠3T3-L1細胞和人前脂肪細胞的葡萄糖攝取(Kharitonenkov?A等，J?ClinInvest，2005，115(6)：1627-1635)。隨后的研究進一步表明，FGF-21是通過增加3T3-L1細胞和人前脂肪細胞中葡萄糖載體-1(GLUT-1)的表達來增加非胰島素依賴的葡萄糖攝取的(Arner?P等，FEBS?Lett，2008，582(12)：1725-1730)。與胰島素介導的快速利用葡萄糖不同，FGF-21在葡萄糖攝取方面的效應可持續幾個小時。更重要的是，FGF-21作用下的葡萄糖攝取是非胰島素依賴性的，而且在與胰島素共同存在時可以增加攝取葡萄糖的效應(AlexeiKharitonenkov等，Biodrugs，2008，22(1)：37-44)。FGF-21可以改善胰島β細胞的功能。FGF-21持續處理8周的db/db小鼠餐后血糖正常，葡萄糖清除率得到明顯改善，胰島素的轉錄、表達和分泌增加，但胰島細胞數量沒有變化。另外，在分離的小鼠胰島和INS-1E細胞中，FGF-21可以阻止糖脂毒性和細胞因子介導的編程性細胞死亡，保護胰島β細胞的數量和功能，抑制葡萄糖介導的胰高血糖素的釋放(Wente?W等，Diabetes，2006，55：2470-2478)。在非人類靈長類糖尿病動物模型方面，注射重組人FGF-21可以降低LDL膽固醇含量，增加HDL膽固醇含量，降低患心血管方面疾病的風險(Kharitonenkov?A等，Endocrinology，2007，148：774-781)。在目前進行的重組人FGF-21動物體內藥效學實驗中，未發現有低血糖、水腫和肥胖增多等其他糖尿病經常出現的副反應出現，顯示出了良好的應用前景和安全性。