[發(fā)明專利]人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21原核細(xì)胞中可溶性表達(dá)及制備

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010552880.5
• 申請(qǐng)日: 2010-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN102465129A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚克海;陳海容;陳清;劉洪洪;范開
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C07K14/50;C12N15/63;C12N15/70;C12P21/02
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1.一種重組制備人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21(Fibroblast?Growth?Factor?21，F(xiàn)GF-21)的方法，通過構(gòu)建含編碼人FGF-21蛋白cDNA的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，可溶性表達(dá)和純化人FGF-21蛋白。

2.權(quán)利要求1所述人FGF-21的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1，特征在于野生型人FGF-21的氨基末端含有添加的甲硫氨酸殘基，可表述為Met-FGF-21。

3.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，含有編碼人Met-FGF-21核苷酸序列SEQID?NO：2。

4.權(quán)利要求1或3所述的表達(dá)載體，其特征在于，其為原核表達(dá)載體。

5.權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，其源自pET。

6.權(quán)利要求1所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，其為大腸桿菌BL21(DE3)PlysS。

7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包含以下步驟：

1)通過固體培養(yǎng)基活化含人FGF-21表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，再30～37℃培養(yǎng)種子液10～16hr；

2)按體積比1∶10接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到6.0～8.0，0.2～0.5mM?IPTG誘導(dǎo)8～12hr。培養(yǎng)溫度30～37℃，誘導(dǎo)溫度23～32℃；

3)低溫高速離心獲得含人FGF-21蛋白的菌體；

4)采用高壓勻漿或超聲破菌，低溫高速離心收集上清；

5)通過鹽析對(duì)破菌上清進(jìn)行初步純化；

6)再采用疏水層析、陰離子交換層析和反相層析精純化重組人FGF-21。

8.權(quán)利要求7所述方法制備的重組人FGF-21具有高的生物活性和高均一性的特點(diǎn)。