[發明專利]革蘭陰性菌脂多糖(內毒素)比色檢測試劑盒的制備及其使用方法

無效

• 申請號: 201010552719.8
• 申請日: 2010-11-22
• 公開（公告）號: CN102305788A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 苑慶華;何永勝
• 申請（專利權）人: 天津市一瑞生物工程有限公司
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬領域：

生物醫藥范疇，更確切說是應用人工合成顯色基質，利用革蘭陰性菌內毒素激活東方鱟血細胞裂解物中C因子，從而水解合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)進而發生縮合反應而定量檢測細菌內毒素方法及相關應用于臨床早期診斷革蘭陰性細菌感染的產品。

背景技術：

經初步檢索，未查到以人工合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)制備成比色檢測革蘭陰性菌內毒素試劑專利。

發明內容：

本發明是以人工合成顯色基質Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)利用微量細菌內毒素特異性地激活東方鱟血細胞裂解物中含有的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，從而誘發東方鱟血細胞裂解物凝固化反應。被激活的凝固酶水解合成顯色基質釋放出顯色基團DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)，DIAN與1-萘酚-4-磺酸鈉、(1-萘酚-2-磺酸鈉或1-萘酚-5-磺酸鈉)在高碘酸鈉存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定范圍內呈線形關系，從而定量檢測出樣品中細菌內毒素濃度。該試劑盒可以用來早期診斷臨床革蘭陰性菌內毒素感染。參照說明書附圖將本發明內敘述如下：

一、合成顯色基質

采用生物技術人工合成Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)類顯色基質。具體合成工藝(見工藝路線圖)。

二、東方鱟血細胞裂解物提取、分離

2.1?血細胞裂解液配制：其中裂解液中成分應含有Na⁺，Mg²⁺，Ca²⁺等金屬離子，調節pH后并進行121℃?90分鐘滅菌處理后方可使用。

2.2?血細胞裂解：無菌操作，取約20g血細胞，按照1-5比例加入血細胞裂解液，并用高速均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，將破損后的組織細胞液放入-30℃冰箱內快速冷凍保存10小時，之后將冷凍細胞液取出，在室溫下緩慢溶解，待全部溶解后，再用高速組織均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，然后將破損后的組織細胞液再次放入-30℃冰箱內快速冷凍保存10小時，重復上次過程2遍即可。

2.3?血細胞分離、提取：將上述血細胞裂解液取出后進行3000rpm/min，5-8分鐘離心，取上清液，按照1-2比例加入氯仿，劇烈震蕩10分鐘，然后轉移至無熱原離心沉淀管中在4℃下進行10000rpm/min，5-10分鐘分離，仔細取出上清液備用。

三、顯色合成基質及縮合溶液的配制及處理

1、顯色合成基質溶液配制

將顯色合成基質用滅菌注射用水溶解，配制成6mM濃度，使用0.22um濾膜過濾，4℃保存備用。

2、顯色液A

為6mM的1-萘酚-4-磺酸鈉溶液(使用pH?8.5濃度為0.05mol的硼酸緩沖液配制)。

3、顯色液B

為2％高碘酸鈉溶液(使用注射用水配制)。

4、顯色液A及顯色液B處理

將上述顯色液A及顯色液B配制后，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然后進行冷凍干燥。

5、顯色合成基質溶液處理

將顯色合成基質溶液，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然后進行冷凍干燥。

四、反應主劑的制備與標定

1、取提取、分離好的東方鱟血細胞的上清液，加到含有1.0M氯化鎂0.5M氯化鈣溶液中，分裝至西林瓶或安瓿瓶中進行冷凍干燥即為反應主劑。

2、取上述冷凍干燥好的反應主劑，按照標示值加入溶解液使其完全溶解，然后用滅菌注射用水1-10倍稀釋，用紫外分光光度計檢測，應在270±3nm處有吸收峰。

3、將細菌內毒素標準品用溶解液溶解并稀釋成最終濃度為50pg/ml溶液，與反應主劑反應，應出現反S型檢測峰。

五、革蘭陰性菌脂多糖(內毒素)比色檢測試劑盒的性能